[发明专利]一种小麦遗传转化受体的培养方法及应用

权利要求书

1.一种利用小麦遗传转化受体即分生组织团培养快速获得再生植株的方法，其特征包含下列步骤：

（1）将冬小麦或春小麦的种子灭菌：选取健康、饱满的成熟冬小麦或春小麦种子放入三角瓶中，用75%酒精处理3-5分钟，无菌水冲洗1-3次，0.1%升汞溶液处理7-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14-18h，备用；

（2）在超净工作台中，用灭过菌的手术刀或解剖针取出冬小麦或春小麦种子成熟胚，接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织，每15d继代一次；继代时保留膨大基部并切去伸展的叶片组织，培养至30天以后获得外露或被残留叶片包被、表面光滑、呈绿色或浅绿色的细胞组织致密的分生组织团，其直径>5mm，培养至40d~50d为分生组织团产生高峰；前述培养过程中的前15d进行暗培养，之后进行光培养，即每天光照16h，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃；

（3）将步骤（2）所得的分生组织团接入分化培养基上培养，至产生丛生芽；

（4）将步骤（3）所得的丛生芽分离后接入生根培养基上培养至获得生根苗；

（5）依据小麦的类型，将步骤（4）所得的冬小麦生根苗进行春化处理，即在4℃下处理15-25d，对所获得的春小麦生根苗不进行春化处理；将上述生根苗炼苗后移栽；

上述步骤中涉及的培养基组分及配比如下所示：

诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4-D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；

分化培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；

生根培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸，琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8。

2.如权利要求1所述的方法在小麦遗传转化中的应用，其特征包含如下步骤：

（1）将冬小麦或春小麦的种子灭菌：选取健康、饱满的成熟冬小麦或春小麦种子放入三角瓶中，用75%酒精处理3-5分钟，无菌水冲洗1-3次，0.1%升汞溶液处理7-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14-18h，备用；

（2）在超净工作台中，用灭过菌的手术刀或解剖针取出冬小麦或春小麦种子成熟胚，接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织，每15d继代一次；继代时保留膨大基部并切去伸展的叶片组织，培养至30天以后获得外露或被残留叶片包被、表面光滑、呈绿色或浅绿色的细胞组织致密的分生组织团，其直径>5mm，培养至40d~50d为分生组织团产生高峰；前述培养过程中的前15d进行暗培养，之后进行光培养，即每天光照16h，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃；

（3）选取冬小麦或春小麦分生组织团进行遗传转化，即：基因枪轰击前4-6h将小麦分生组织团接入高渗培养基，在1100psi/6cm或1350psi/9cm条件下轰击，轰击后继续在高渗培养基上处理16～18h；

（4）将步骤（3）转化后的材料接入筛选培养基中，培养30-60d，得到再生抗性幼芽；

（5）将步骤（4）得到的抗性幼芽少量进行GUS染色，鉴定转基因是否成功，将大量抗性幼芽接入生根筛选培养基中，直至得到生根苗；

（6）将步骤（5）得到的生根苗中的冬小麦进行春化处理，即在4℃下处理15-25d，对春小麦无需进行春化处理；将上述生根苗炼苗后移栽，得到抗性植株；

（7）对步骤（6）获得的抗性植株进行GUS染色或进行PCR扩增或除草剂抗性检测以鉴定是否为转基因植株；

（8）采用touchdown PCR方法进行扩增，扩增用的引物对的DNA序列如下所示：

上游引物：5'-CAAATCTCGGTGACGGGCAGGA-3'，

下游引物：5'-CTGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3'；

反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环；后随退火温度递减2度重复3个循坏即：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环……至退火温度为44℃，重复16个循环；72℃继续延伸5min；10℃保温1h。

（9）用含有200mg/L草丁膦的水溶液涂抹抗性植株叶片的两面，将6d后转基因植株保持绿色或仅叶尖部位呈黄色的植株选留，将叶片尖端至叶中明显变黄的非转基因植株剔除；

上述培养中的培养基组分及配比如下所示：

诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4-D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；

高渗培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4-D+0.4mol/L甘露醇，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；

筛选培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲+5mg/L草丁膦，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至；5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高压蒸汽灭菌15分钟；其中草丁膦在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入草丁膦混匀备用；

生根筛选培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸+2mg/L草丁膦，琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高压蒸汽灭菌15分钟；其中草丁膦在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入草丁膦混匀备用。