[发明专利]一种培育富含花青苷烟草的方法及其应用

摘要

本发明提供一种培育富含花青苷烟草的方法。以杨梅果实中已确认的可调控花青苷合成的两个基因MrMYB1和MrbHLH1重组，构建成表达质粒，采用烟草叶片瞬时表达技术筛选可调控花青苷合成的基因，将确认功能的基因转化到烟草，培育出富含花青苷的烟草。本发明提供了一种培育富含花青苷烟草的方法，使得减轻吸烟带来的健康危害成为可能。本方法同样适用于杨梅以外的MYB和bHLH基因。

主权项

一种培育富含花青苷烟草的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）表达载体构建：根据序列为SEQ：NO. 1的MrMYB1的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点的序列为SEQ：NO. 2和SEQ：NO. 3的引物对，根据序列为SEQ：NO. 4的MrbHLH1的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点序列为SEQ：NO. 5和SEQ：NO. 6，PCR的引物对，扩增两个基因的开放性阅读框，然后采用相应的内切酶处理扩增产物和表达质粒pGreenII SK，最后通过连接相对应的PCR产物和质粒，分别进行MrMYB1和MrbHLH1过量表达载体的构建；（2）双价表达载体构建：根据表达质粒pGreenII SK序列为SEQ：NO. 7，设计序列为SEQ：NO. 8和SEQ：NO. 9的引物对，扩增CaMV 加尾信号序列，引物对SEQ：NO. 10和SEQ：NO. 11扩增35S启动子序列，根据融合PCR技术原理设计引物对SEQ：NO. 12和SEQ：NO. 13扩增MrMYB1的开放性阅读框片段，引物对SEQ：NO. 14和SEQ：NO. 15扩增MrbHLH1的开放性阅读框片段，应用融合PCR技术进行含MrMYB1‑MrbHLH1双价载体的构建，第一轮PCR分别扩增出CaMV加尾信号、35S启动子、MrMYB1和MrbHLH1序列，第二轮PCR扩增出中间产物模板，第三轮PCR扩增出最终融合目的片段；（3）基因的功能预测：应用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达技术，将含有各表达载体的农杆菌渗透液，输入烟草叶片表皮细胞内，植株置于温室培养8天后观察叶片中花青苷合成情况，若输入孔周围有花青苷积累，说明输入叶片的基因具有诱导花青苷积累的功能；（4）烟草转基因技术：将采用瞬时表达技术筛选的含有效基因表达载体的农杆菌菌株浸染带有伤口的无菌烟草组培苗叶片，然后置于含抗生素的不定芽诱导培养基培养4周，再转到含抗生素的根诱导培养基上培养4周，得到完整的转基因植株，最后经过炼苗，将植株置于室外培养至开花结果。