[发明专利]一种培育富含花青苷烟草的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种培育富含花青苷烟草的方法及其应用。 

背景技术

吸烟严重影响人体健康。吸烟不仅可诱导心血管病、慢性肺病和癌症，而且会增加传染病的发生概率，直接导致严重流行性感冒、侵入性肺炎和结核病的发病几率上升；引起众多的生殖并发病，包括不育、自发性流产、婴儿体重过轻和夭折等综合症状；使人体产生胰岛素抗性，是糖尿病发病的重要因素，而且会加速吸烟者患血管病的进程；还会影响手术后身体的恢复，包括延缓伤口愈合和增加伤口感染的几率等。 

随着人们健康观念的不断提升，发达国家中烟民的数量有所减少，然而在较多发展中国家中，仍有超过40% 人口的烟民。多数烟民都有严重的烟瘾，从而无法通过戒烟来避免吸烟引起的疾病。对于这部分烟民来说，选择含较少有害物质的烟草可能是一个可行的策略。 

花青苷属于黄酮类化合物，广泛存在于绝大部分陆生植物的液泡中，是红色、蓝色和紫色色泽的主要构成物。花青苷具有多种重要功能。除作为天然色素外，花青苷还具有很强的抗氧化、清除氧自由基的能力，是具有保健功能的天然活性物质，被誉为继水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质之后的第七大必需营养。长期以来，花青苷已成为植物营养素或食品健康的重要标志。由于其具有极高的抗氧化活性，花青苷对心血管疾病、神经元和衰老相关疾病和癌症等均具一定预防功效。本实验室研究发现，杨梅果实中花青苷等酚类物质的含量与抗氧化活性呈显著正相关关系，其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是杨梅果实中主要的抗氧化物质；通过口服糖耐量试验(OGTT)发现，杨梅果实花青苷粗提物可显著降低大鼠血糖，改善糖尿病鼠的糖耐量能力；杨梅果实花青苷可抑制肿瘤细胞MMP-2蛋白的表达，从而抑制胃癌肿瘤细胞的活性。此外，花青苷还可有效抑制肥胖和降低血脂，改善血糖平衡，促进视紫红质再生进而增强视力敏锐性，预防大脑中枢栓塞和缺血症状。因而花青苷成为天然色素中最具有发展前景的一类色素。 

花青苷的代谢途径已较为透彻，目前研究已达到转录调控的水平。即在花青苷的合成代谢过程中，相关的合成基因呈现较严格的时间和空间上的协同表达现象，经研究发现，这种现象是由转录调控基因统一调节的。花青苷合成相关的转录调控基因主要涉及三大转录因子家族，分别是R2R3-MYB转录因子、basic helix-loop-helix（bHLH）转录因子和WD40蛋白。由这三大转录因子构成的MYB-bHLH-WD40（MBW）转录复合体，对花青苷生物合成的后期合成基因的表达的转录调控尤为显著。其中，MBW 转录复合体中MYB 和bHLH 转录因子对花青苷的合成调控较为特异。 

发明内容

本发明的目的是提供一种培育富含花青苷烟草的方法，使得减轻吸烟带来的健康危害成为可能。以杨梅果实中已确认可调控花青苷合成的MrMYB1 和MrbHLH1为例，对该发明方法进行具体阐述。本发明方法同样适用于杨梅以外其他可调控花青苷合成的MYB 和bHLH 基因。 

本发明的具体实施步骤如下： 

1、表达载体构建：根据已确认的MrMYB1（SEQ：NO. 1）的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点的引物对SEQ：NO. 2和SEQ：NO. 3，根据已确认的MrbHLH1（SEQ：NO. 4）的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点的引物对SEQ：NO. 5和SEQ：NO. 6。以杨梅成熟果实cDNA为模板，PCR扩增两个基因的开放性阅读框，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收后经相应限制性内切酶处理，酶切产物再次用1%琼脂糖凝胶电泳，回收，然后连接到同样经相应限制性内切酶处理的pGreenII SK表达载体上，分别进行MrMYB1和MrbHLH1过量表达载体的构建。