[发明专利]一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法，其中包括如下工序：在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和干扰素α培养条件下，并负载一个或多个肿瘤特异糖蛋白，快速、简便获得具有抗肿瘤作用的树突状细胞疫苗。该树突状细胞疫苗高表达共刺激分子CD80、CD83和CD86。其中，CD80+/CD11c+细胞为98.0％，CD86+/CD11c细胞为85.2％，CD83+/CD11c+细胞为84.3％。本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的树突状细胞疫苗的基础研究和临床应用中。

主权项

一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁；在37℃、5％CO2培养箱中孵育60min后，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含有1500IU/mLGM‑CSF、500IU/mL IFN‑α、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠和5％的自体血清；于37℃、5％CO2培养箱中培养；在培养到第三天时细胞半量更换新鲜培养基，该新鲜培养基含1500IU/mL GM‑CSF、500IU/mLIFN‑α；并添加200ng/mL一个或多个肿瘤特异糖链抗原，负载于树突状细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；培养到第五天收获具有抗肿瘤作用的树突状细胞疫苗；所述的树突状细胞疫苗高表达共刺激分子CD80、CD83和CD86；将所述的树突状细胞疫苗进行细胞活率和细胞表型检测；所述细胞活率检测方法为：计算培养最后一天的活细胞数；取1mL最后一天培养的培养液，1000rpm、4℃下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液周1×PBS稀释20倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98％以上；所述细胞表型检测方法为：取苔盼兰染色计数后的3×106细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD80单抗、20μLPE标记鼠抗人HLA‑DR单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD11c单抗；第二组分别添加20μLFITC标记鼠抗人CD86单抗、20μL PE标记鼠抗人CD83单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD11c单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μLPE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。