[发明专利]一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法。本发明涉及的促进人外周血、骨髓和脐血中单个核细胞快速诱导并负载肿瘤特异糖蛋白为树突状细胞疫苗，高表达共刺激分子，具有激活机体效应性T淋巴细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的免疫治疗。

背景技术

目前，癌症的细胞免疫治疗给患者提供继三大常规治疗的“第四种模式”，没有放化疗带来的巨大毒副作用，达到了相对安全，提高了患者生活品质，有尊严的治疗方式。树突状细胞在该细胞免疫治疗中起着主要作用，并在临床治疗中应用。

人体内每一个糖基转移酶均有一个基因编码，每个糖基转移酶均催化特定的糖苷键的合成。如果合成糖链的糖基转移酶的基因发生部分缺失、增加等突变，则可导致编码异常的糖基转移酶，从而使细胞发生癌变。这种变异的糖链能作为抗原并被相应的抗体识别，故称其为糖链抗原。因其主要且大量的在癌细胞中产生，正常组织或良性病变几乎不产生，故有学者将其称为癌抗原。

糖链抗原15-3是从转移性乳腺癌中分离的一种肿瘤相关抗原，CA15-3水平与乳腺癌的复发转移密切相关，当CA15-3＞100U/ml时，可肯定有转移。

CA54-9也是乳腺癌的标志物，可见于50％乳腺癌、卵巢癌、40％前列腺癌、33％肺癌患者中。

CA50是一种唾液酸酯和唾液酸糖蛋白，正常组织中一般不存在，当细胞恶变时，糖基化酶被激活，造成细胞表面糖基结构改变而成为CA50标志物。许多恶性肿瘤患者血中皆可升高，如66.6％的肺癌、88.2％的肝癌、68.9％的胃癌、88.5％的卵巢或子宫颈癌、94.4％胰或胆管癌，其他如直肠癌、膀胱癌等皆有70％以上是升高的。

CA125最初认为是卵巢癌特异的，但深入研究，它也是一种广谱的肿瘤标志物。

CA19-9为唾液酸化的乳-N-岩藻戊糖II，是一种类粘蛋白的糖蛋白成分。血清内正常值＜37×10³U/L(＞95％)，异常升高也是在多种肿瘤出现，如79％胰腺癌、58％结肠癌、49％肝癌、67％胃癌、67％胆囊癌、肺癌、乳腺癌皆有10％左右是升高的。

CA72-4是一种高分子量糖蛋白，正常人血清中含量＜6×10³U/L，异常升高在各种消化道肿瘤、卵巢癌均可产生。对于胃癌的检测特异性较高，

CA242是一种唾液酸化的鞘糖脂类抗原，几乎总是和CA50一起表达，但两者受不同的单克隆抗体识别。对胰腺癌的诊断，CA242优于CA19-9，敏感性可达66％～100％，对大肠癌的敏感性也达60％～72％。CA242的敏感性由高至低依次为肝癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌。

TAG-72是一种分子量大于1,000KDa的粘液蛋白，除分泌腺上皮外，其它正常上皮一般不表达，主要用于结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、内膜癌和肺癌的研究。亦可用于肺癌(TAG-72⁺)和恶性间皮瘤(TAG-72^-)的鉴别诊断。

针对以靶向肿瘤特异表达糖链抗原进行肿瘤临床治疗，发挥特异性的抗肿瘤免疫应答，本发明不需要进行肿瘤抗原表位多肽的筛选以及受HLA-A2阳性的限制，采用了体外GM-CSF和IFN-α诱导并直接负载一个或多个肿瘤特异糖链蛋白，快速、简便获取树突状细胞疫苗，从而促进树突状细胞具有更好的靶向抗肿瘤免疫应答作用。

发明内容

现有技术主要通过两步法外诱导和成熟过程获得树突状细胞疫苗，培养时间为7天，操作复杂。本发明技术一步法获取树突状细胞，不需要进行肿瘤抗原表位多肽的筛选以及受HLA-A2阳性的限制，通过体外直接诱导和负载一个或多个肿瘤特异糖链蛋白，激发树突状细胞更好的靶向抗肿瘤免疫应答作用。

本发明涉及一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下工序：在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α(IFN-α)培养条件下，并直接负载一个或多个肿瘤特异糖链蛋白，获取树突状细胞疫苗。

本发明所述的肿瘤特异糖链抗原优选CA72-4、CA50、CA24-2、CA15-3、CA24-2、CA19-9、CA12-5、肿瘤相关糖蛋白-72(Tumor-associated Glycoprotein-72，TAG-72)等。

本发明所采用的培养瓶优选6孔培养板、25cm²或75cm²培养瓶，或选用塑料培养皿。