[发明专利]一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法

摘要

本发明涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，属生物技术领域。该方法在检品供试品的制备中采用蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420µl，以总体积为基准，加入蛋白酶K、1/10体积的蛋白酶K缓冲液和1/6体积的超滤浓缩液，混匀后于孵育；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白含量的2～8倍。本发明方法消除了各群结合物载体蛋白在免疫电泳中的影响，建立了检测4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖的适宜检测体系，提供了一种准确、快速测定4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的方法，该方法具有耐用性强、准确性及精密度高的特点，建立了评价脑膜炎球菌多糖结合疫苗质量的方法。

主权项

一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，包括以下步骤：（1）检品供试品的制备①预处理：取待检测的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶后，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420µl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液、蛋白酶K，蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白含量的2～8倍，并补加注射用水至420µl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品；（2）抗血清琼脂糖胶板的制备称取琼脂糖，加入pH8.6的巴比妥电泳缓冲液使胶浓度为1.5%，加热溶胀完全，放56℃水浴10～30min，加入预测定群对应的效价为1：640的特异性抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；（3）上样待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂，然后在其余各孔依次分别加入预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品、检品供试品，加入量均为7µl/孔；（4）电泳及胶片处理按常规方法进行电泳、干胶制备、染色和脱色处理；（5）结果计算用游标卡尺量取预测定群对应的各多糖标准品及检品供试品的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将检品供试品峰高值带入回归曲线计算供试品多糖含量。