[发明专利]一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法。

背景技术

脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品多糖（抗原）含量是确保疫苗有效性的基本条件之一。对于单独结合物原液多糖含量，A群可通过测定磷含量获得，C、Y、或W135群可通过测定唾液酸含量获得，而4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品，如A、C、Y、W135群结合疫苗成品中A、C、Y、W135群结合物混合在一起，且C、Y、W135群均含有唾液酸，故无法通过测唾液酸含量获得C、Y、W135各群多糖含量。

《火箭免疫电泳法定量检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法学验证》（林云等，发表于在国际生物制品学杂志2008年12月第31卷第6期）中介绍了一种检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法，解决了测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品各群多糖含量的技术问题，但该方法不适用于测定结合疫苗成品中各群多糖含量，因为实验证明，结合疫苗中各群结合物的载体蛋白会对火箭免疫电泳产生影响，导致结果不能真实准确地反映多糖含量，故测定3个群以上的多糖结合疫苗成品包括A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量是一个技术难点，目前尚无该多糖结合疫苗成品各群多糖含量测定方法的相关报道，需建立一种方法准确测定该多糖结合疫苗成品中A、C、Y、W135等各群的多糖含量。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 这种反应即可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的特点主要有三性：即特异性、比例性、可逆性。 特异性，是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。这种高度的特异性在传染病的诊断与防治方面得到有效的应用。随着免疫学技术的发展进步，还将在医学和生物学领域得到更加深入和广泛的应用，比如肿瘤的诊断和特异性治疗等。比例性，是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原过剩或抗体过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。可逆性，是指抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离恢复为抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离后的抗原抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性。

火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度地单向扩散。在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距2—3mA／cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量成正比，用已知量标准抗原作对照，可以方便地测定未知标本中的抗原含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术还没有能对3个群以上多糖结合疫苗成品中各群的多糖含量进行测定的方法，导致该多糖结合疫苗成品质量难以控制，其目的是提供一种可以准确、快速测定脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的方法。

为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明所述的一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）检品供试品的制备

①预处理：取待检测的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶后，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液、蛋白酶K，蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白含量的2～8倍，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品；

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备