[发明专利]一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法

摘要

本发明提供一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过先获得基因3’端序列，再通过3'RACE技术获得柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列；采用Q-PCR技术分析ADH和PDC基因家族成员在柿果实脱涩处理中的基因表达；分离得到柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列，然后建立柿叶片瞬时表达体系。本发明方法是克隆出柿子脱涩相关的基因家族成员，分析这些家族成员在柿子脱涩处理中的表达模式，最后通过柿子叶片的瞬时表达验证目的基因的功能，从分子机制上阐明了柿子采后脱涩的调控机制，有利用进一步开展柿子采后脱涩机制的转基因，基因互作等功能验证研究。

主权项

一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过以下步骤实现： （1）柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列的获得：首先进行柿子组织RNA的提取，3'CDNA和5'CDNA逆转录得到CDNA模板，通过查找NCBI数据库上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成员序列，然后用ClustalX  v 1.81软件比对找到保守区间并在其间设计兼并引物SEQ ID N0：1和SEQ ID N0：2，克隆2个ADH基因部分编码片段SEQ ID N0：39和SEQ ID N0：40；根据前面兼并克隆到的ADH编码区片段以及NCBI上已公布的ADH 和PDC基因家族EST序列，设计引物SEQ ID N0：3~16，利用3'RACE克隆技术体系，PCR扩增，片段回收，连接，转化，涂板，送测，最终分别获得了 3个ADH和4个PDC基因家族成员的3’端序列SEQ ID N0：41~47；（2）柿果实中ADH和PDC基因家族成员在柿果实脱涩处理中的基因表达分析：首先完成柿子二氧化碳和乙烯脱涩处理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步骤（2）中得到的3’端序列的UTR区设计特异引物SEQ ID N0：17~30，引物特异性检测，熔点曲线分析、凝胶电泳分析和定量PCR产物再测序确认序列的正确性，实时定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成员在处理与对照中的表达模式；（3）柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列的获得以及柿叶片瞬时表达体系构建：根据获得的3’端序列设计5’RACE引物SEQ ID N0：31~34，以步骤（1）中得到的5’RACE CDNA为模板，利用5'RACE克隆技术体系，最终分别获得 1个ADH和1个PDC 5’ 端序列，分别设计跨起始子和终止子的上游引物和下游引物，SEQ ID N0：35~38，以步骤（2）中得到的CDNA为模板，克隆并得到ADH和PDC的目的基因SEQ ID N0：48和SEQ ID N0：49,选取公司返回的带有ADH和PDC的全长基因的质粒用于下面的双酶切，构建表达载体，电导转化，农杆菌制备，甘油菌零下80℃保存，将保存的甘油菌接种至kan50的LB平板，28 oC培养2天，转移至kan50的LB平板培养1天，实验的前一天，再转移至新的LB平板培养，再将kan50的LB平板上的农杆菌转移到装有注射夜的离心管里，摇匀，选择成熟度一致的“磨盘柿”叶片，叶片背面以叶脉为对称轴，两边分别注射带有SK和目的基因SEQ ID N0：48或SEQ ID N0：49的农杆菌培养液，三天后采摘叶片，带回实验室，沿叶片注射的边缘剪下，用液氮速冻分别取样，样品保存在零下80℃下供下一步实验用，每个基因各注射10片柿叶，对样品进行可溶性单宁含量测定，分析叶片瞬时表达的效应。