[发明专利]一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法

说明书

技术领域  

本发明属于生物工程技术领域，涉及了柿子脱涩相关基因的克隆表达，以及柿叶片基因瞬时表达的体系建立。

背景技术         

柿原产中国，其味道鲜美，对人类健康良好，是东亚地区(中国，日本，韩国等)最受欢迎的水果之一，柿子的独特之处在于其果实在发育期间能累积单宁（PAs），单宁是高分子物质，其中可溶性单宁是柿果实涩味的主要呈现物质。

柿子根据其脱涩类型以及种子是否影响果实的涩味及颜色可以分为四类：完全甜柿 (PCNA)；完全涩柿（PCA)；非完全甜柿(PVNA)；非完全涩柿(PVA)。甜柿果实发育早期丧失合成单宁的能力，故其在树上能自然脱涩，成熟采收时果实不呈涩味，可直接食用；涩柿果实采后需经脱涩处理后方可食用。

柿果的脱涩研究已经取得了很大的成功，例如树上乙醇蒸气包裹果实，高浓度的二氧化碳或氮气处理，温水浸泡或者交替冻融等都能完成脱涩。而且研究表明高浓度的二氧化氮处理能够使柿果在脱涩的同时保脆。

关于柿果脱涩的机制很早以前就有人开始研究了。已有研究报道，脱涩处理过程中伴随着大量的乙醛累积。Matsuo 和Ito (1977) 提出二氧化碳脱涩处理中涉及了两个相对独立的过程。首先，果实在二氧化碳处理条件下通过无氧呼吸累积大量的乙醛。其次，乙醛与可溶性单宁结合成一种不涩的不溶性物质，促使果实脱涩。Matsuo等(1991) 也证明了无氧呼吸中产生的乙醛直接参与了柿子的脱涩。因此乙醛介导的可溶性单宁缩合反应是柿果实脱涩的核心。Yamada等（2002）研究认为，ADH和PDC是柿果实内乙醛合成的关键酶，但至今为止，ADH和PDC两基因在柿果实脱涩研究中的调控机制仍未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过以下步骤实现： 

1．柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列的获得：

首先进行柿子组织（果肉，茎，叶，和花）RNA的提取，3'CDNA和5'CDNA逆转录得到CDNA模板，通过查找NCBI数据库上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成员序列，然后用ClustalX (v 1.81)软件比对找到保守区间并在其间设计兼并引物（SEQ ID N0：1；SEQ ID N0：2），克隆2个ADH基因部分编码片段（SEQ ID N0：39；SEQ ID N0：40）；

根据前面兼并克隆到的ADH编码区片段以及NCBI上已公布的ADH 和PDC基因家族EST序列，设计引物（SEQ ID N0：3~16），利用3'RACE( rapid ampli?cation of cDNA ends)克隆技术体系，PCR扩增，片段回收，连接，转化，涂板，送测，最终分别获得了 3个ADH和4个PDC基因家族成员的3’端序列（SEQ ID N0：41~47）。

2．柿果实中ADH和PDC基因家族成员在柿果实脱涩处理中的基因表达分析：首先完成柿子二氧化碳和乙烯脱涩处理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步骤2中得到的3’端序列的UTR区设计特异引物(SEQ ID N0：17~30)，引物特异性检测，熔点曲线分析、凝胶电泳分析和定量PCR产物再测序确认序列的正确性。实时定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成员在处理与对照中的表达模式。

3、柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列的获得以及柿叶片瞬时表达体系构建：根据获得的3’端序列设计5’RACE引物（SEQ ID N0：31~34），以步骤1中得到的5’RACE CDNA为模板，利用5'RACE( rapid ampli?cation of cDNA ends)克隆技术体系，最终分别获得了 1个ADH和1个PDC 5’ 端序列。分别设计跨起始子和终止子的上游引物和下游引物（SEQ ID N0：35~38），以步骤2中得到的CDNA为模板，克隆并得到ADH和PDC的全长基因（SEQ ID N0：48；SEQ ID N0：49）,选取公司返回的带有ADH和PDC的全长基因的质粒用于下面的双酶切，构建表达载体，电导转化，农杆菌制备，甘油菌零下80℃保存，将保存的甘油菌接种至LB（kan50）平板，28 ^oC培养2天，再转移至新的LB（kan50）平