[发明专利]高纯度牛胰蛋白酶的制备方法

摘要

本发明提供了一种从动物胰脏中制备高纯度胰蛋白酶的方法，包括加入提取剂提取、离心、加入盐析沉淀剂沉淀、溶解、超滤、离子交换层析柱、调pH至碱性加氯化钙活化、调pH值至酸性终止活化，检测胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力、测A280值、超滤膜浓缩、监测透过液直至A280值小于0.5、合并浓缩液和冲洗液即为高纯度胰蛋白酶；本发明的工艺制备方法得到的胰蛋白酶纯度高，催化作用专一性强。

主权项

一种从动物胰脏中制备高纯度胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：（1）取动物胰脏，先进行组织破碎，加入至少2倍体积的提取剂，该提取剂是pH 3以上的无机或有机酸，提取至少12小时；（2）提取后的样品进行离心，收集上清液体；（3）将上清液加入盐析沉淀剂进行沉淀，至沉淀不再析出，得到的沉淀即为粗酶原I；（4）用磷酸缓冲液溶解粗酶原I，用超滤膜超滤，从超滤开始随时监测透过液A280值，至A280<0.5时停止超滤，浓缩样品至提取剂体积的1/10左右，得到粗酶原II；（5）将粗酶原II上到已平衡好的离子交换层析柱上，上样过程随时监测流出液A280值，用Buffer A平衡3‑5倍柱体积，再用Buffer A和Buffer B加0.1‑0.4mol氯化钠，进行线性洗脱，流速2‑5ml/min，随时监测流出液A280值；收集样品，于容器中测量体积和A280值，得到样品III，于2‑8℃保存备用；该Buffer A为10m mol柠檬酸与0.1mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；Buffer B为10m mol柠檬酸与0.4mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；（6）样品III调pH至碱性后，加氯化钙进行活化，测A280值，随时检测活力至活力升至最高时，调pH值至酸性，终止活化，检测胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力；测A280值，此为样品IV，于2‑8℃保存备用；（7）将样品IV用准备好的3‑10K超滤膜浓缩，此过程随时监测透过液A280值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A280值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液，即得；该Buffer L为10m mol柠檬酸。