[发明专利]高纯度牛胰蛋白酶的制备方法

权利要求书

1.一种从动物胰脏中制备高纯度胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：

（1）取动物胰脏，先进行组织破碎，加入至少2倍体积的提取剂，该提取剂是pH 3以上的无机或有机酸，提取至少12小时；

（2）提取后的样品进行离心，收集上清液体；

（3）将上清液加入盐析沉淀剂进行沉淀，至沉淀不再析出，得到的沉淀即为粗酶原I；

（4）用磷酸缓冲液溶解粗酶原I，用超滤膜超滤，从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值，至A₂₈₀<0.5时停止超滤，浓缩样品至提取剂体积的1/10左右，得到粗酶原II；

（5）将粗酶原II上到已平衡好的离子交换层析柱上，上样过程随时监测流出液A₂₈₀值，用Buffer A平衡3-5倍柱体积，再用Buffer A和Buffer B加0.1-0.4mol氯化钠，进行线性洗脱，流速2-5ml/min，随时监测流出液A₂₈₀值；收集样品，于容器中测量体积和A₂₈₀值，得到样品III，于2-8℃保存备用；该Buffer A为10m mol柠檬酸与0.1mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；Buffer B为10m mol柠檬酸与0.4mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；

（6）样品III调pH至碱性后，加氯化钙进行活化，测A₂₈₀值，随时检测活力至活力升至最高时，调pH值至酸性，终止活化，检测胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力；测A₂₈₀值，此为样品IV，于2-8℃保存备用；

（7）将样品IV用准备好的3-10K超滤膜浓缩，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液，即得；该Buffer L为10m mol柠檬酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的提取剂为0.1-0.15mol/l的硫酸或盐酸或2-4%的三氯乙酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）中采用的盐析沉淀剂为溶解度超过200g/L的无机盐，或pH 3以下的酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的盐析沉淀剂为硫酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）为采用盐析沉淀剂沉淀进行分级沉淀处理，该分级沉淀处理为在上清液中依序加入20%、40%浓度的盐析沉淀剂进行分级沉淀。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（4）采用的超滤膜为3k-10k的超滤膜。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）为酶原在活化之前上阳离子交换层析，离子交换介质为SP树脂，平衡缓冲液为Buffer A，洗脱液为5倍柱体积的Buffer A和5倍柱体积的Buffer B，加0.1-0.4mol氯化钠进行线性梯度洗脱，上样过程中监测流出液A₂₈₀值＜0.5以下开始梯度洗脱，洗脱后监测A₂₈₀，收集A₂₈₀＞1至胰凝乳蛋白酶活力＜0.2之间的样品。

8.根据权利要求1所述的制备胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤（6）粗酶原样品III在离子交换层析后，用氢氧化钠调节至碱性，再加氯化钙进行活化，该活化的过程为用氢氧化钠调pH至8.0-8.5，加0.1mol二水氯化钙活化，然后用盐酸调pH至2.5-3.0终止活化。

9.根据权利要求1所述的制备胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤（7）所用超滤膜为3K超滤膜。

10.根据权利要求1所述的制备胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述动物胰脏包括猪、牛、羊的动物的胰脏。