[发明专利]PTD-Apoptin融合蛋白原核分泌表达的构建方法及其应用

摘要

本发明涉及PTD-Apoptin融合蛋白的分泌表达载体的构建方法及其应用。将PTD-Apoptin序列连接到pET22b(+)分泌表达载体上，构建原核分泌表达载体pET22b(+)-PTD-Apoptin，经IPTG诱导，将表达的目的蛋白分泌到大肠杆菌周质空间中，渗透法提取周质空间蛋白，剩余细胞组分经超声破碎后，分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。将周质空间中PTD-Apoptin融合蛋白与胃癌823细胞共孵育，MTT法检测融合蛋白对胃癌823细胞的抑制作用。采用本发明的方法重组PTD-Apoptin蛋白可以分泌至大肠杆菌周质空间中，且以可溶状态存在，分泌表达的重组PTD-Apoptin蛋白具有生物活性，对胃癌823细胞的最大抑制率为82.95%。

主权项

PTD‑Apoptin融合蛋白的构建方法，其特征在于方法如下：1）人工合成两端带有BamHⅠ和EcoRⅠ粘性末端的PTD序列的正、负链，将正链和负链混合，制备成5’端带有BamHⅠ、3’端带有EcoRⅠ粘性末端的PTD双链序列；2）将得到的PTD双链序列插入到分泌表达质粒pET22b(+)的BamHⅠ/EcoRⅠ位点，构建出表达PTD的分泌表达质粒pET22b(+)‑PTD；3）扩增Apoptin序列；4）将Apoptin序列用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒回收，将回收后的酶切片段插入到分泌表达质粒pET22b(+)‑PTD的EcoRⅠ/SalⅠ位点，构建出表达融合蛋白PTD‑Apoptin的分泌表达质粒pET22b(+)‑PTD‑Apoptin；5）将分泌表达质粒pET22b(+)‑PTD‑Apoptin转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；6）将重组大肠杆菌接种于LB培养基中，摇瓶培养过夜，再将培养后的菌液以5%接种量接种于2×YT培养基中进行摇瓶扩大培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在20℃条件下用1.2 mM IPTG诱导10h，之后4℃ 6000rpm离心10min，收集菌体细胞；7）将收集的菌体细胞重悬于含有20%的蔗糖、pH为8、浓度为30mM的30mL Tris‑HCl中，加入pH为8，浓度为0.5M 的EDTA至EDTA终浓度为1mM，加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10min；4℃ 6000rpm离心10 min收集细胞，去除上清液；8）将收集的细胞重悬于30mL冰冻的浓度为5 mM 的MgSO4中，缓慢搅拌悬液10min；4℃ 6000rpm离心10 min收集上清，即为PTD‑Apoptin融合蛋白。