[发明专利]PTD-Apoptin融合蛋白原核分泌表达的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体地涉及一种PTD-Apoptin融合蛋白分泌表达系统的构建及其应用。

背景技术

现今，肿瘤的治疗仍是一项难题。因此，寻找并制备出对肿瘤细胞选择性强、作用性强的制剂是目前肿瘤治疗药物的研究方向。从鸡贫血病毒中分离出的vp3基因（Apoptin）可诱导人肿瘤细胞或转化细胞等非正常细胞的凋亡作用，而对正常的二倍体细胞无作用。Apoptin诱导肿瘤细胞的凋亡不需要肿瘤抑制基因p53的表达，且不受凋亡因子Bcl-2的抑制作用，显示出了Apoptin作为一种抗肿瘤制剂的应用前景。

为了使Apoptin有效地进入肿瘤细胞，需要构建具有穿膜能力的药物分子。利用原核表达体系可获得大量蛋白分子。然而，原核表达体系的胞质表达多以包涵体形式存在，包涵体属变性蛋白，一般不具有活性，需要复性才能恢复活性，但是包涵体复性效率低，对于需求量大的蛋白往往达不到要求，而且包涵体复性时只有极少数蛋白折叠为天然状态，限制其活性。因此，避开包涵体复性过程，实现蛋白以有活性的可溶状态表达，并大量分泌到杂蛋白种类和含量都少的大肠杆菌周质空间中，这是现在亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是构建具有诱导肿瘤细胞凋亡并可以穿过细胞膜的融合蛋白PTD-Apoptin，表达时以可溶状态分泌到大肠杆菌的周质空间中，保留了穿膜功能和特异性诱导肿瘤细胞凋亡功能，无需复性，且融合蛋白分泌到周质空间后，融合蛋白含量占周质空间总蛋白的80%。

本发明采用的技术方案是：PTD-Apoptin融合蛋白的构建方法如下：

1）人工合成两端带有BamHⅠ和EcoRⅠ粘性末端的PTD序列的正、负链，将正链和负链混合，制备成5’端带有BamHⅠ、3’端带有EcoRⅠ粘性末端的PTD双链序列；

2）将得到的PTD双链序列插入到分泌表达质粒pET22b(+)的BamHⅠ/EcoRⅠ位点，构建出表达PTD的分泌表达质粒pET22b(+)-PTD；

3）扩增Apoptin序列；

4）将Apoptin序列用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒回收，将回收后的酶切片段插入到分泌表达质粒pET22b(+)-PTD的EcoRⅠ/SalⅠ位点，构建出表达融合蛋白PTD-Apoptin的分泌表达质粒pET22b(+)-PTD-Apoptin；

5）将分泌表达质粒pET22b(+)-PTD-Apoptin转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；

6）将重组大肠杆菌接种于LB培养基中，摇瓶培养过夜，再将培养后的菌液以5%接种量接种于2×YT培养基中进行摇瓶扩大培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在20℃条件下用1.2 mM IPTG诱导10h，之后4℃ 6000rpm离心10min收集菌体细胞；

7）将收集的菌体细胞重悬于含有20%的蔗糖、pH为8、浓度为30mM的30mL Tris-HCl中，加入pH为8，浓度为0.5M 的EDTA至EDTA终浓度为1mM，加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10min；4℃ 6000rpm离心10 min收集细胞，去除上清液；

8）将收集的细胞重悬于30mL冰冻的浓度为5 mM 的MgSO₄中，缓慢搅拌悬液10min；4℃ 6000rpm离心10 min收集上清，即为PTD-Apoptin融合蛋白。

按上述的方法获得的PTD-Apoptin融合蛋白在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。