[发明专利]一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法

摘要

本发明公开了一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，能同步系列化检测针对特定抗原的特异性胸腺依赖性淋巴细胞的数量及其接受抗原刺激后的反应活性，既高度特异，又简便易行，不需特殊仪器，能极大地降低特异性T细胞检测的难度，易于在一般单位推广应用。系列化检测是指该方法借助微孔反应板能同步检测由一系列人类主要组织相容性抗原所提呈的针对一系列抗原表位的特异性T细胞，使针对靶抗原的检测试剂盒既能覆盖绝大多数人群，又能在一次检测中分析多种抗原表位的特异性T细胞。本方法使分析机体的特异性细胞免疫功能状态变得简单方便，从而可促进免疫性疾病的研究和治疗。

主权项

一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）制备主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体：利用基因工程技术和蛋白质工程技术制备MHC分子与其所提呈的靶抗原的抗原表位肽的复合体分子，再利用生物素‑亲和素系统制备所述主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体；2）制备磁珠式人工抗原提呈细胞：将所述步骤1）中制备的主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体与共刺激分子配体一起共同包被磁性微米球或磁性纳米颗粒，制备得到磁珠式人工抗原提呈细胞；3）制备磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板：在微孔反应板的不同微量反应孔中分别包被抗干扰素‑γ、抗肿瘤坏死因子、抗白细胞介素‑4和抗颗粒酶B抗体，用牛血清白蛋白封闭所述微量反应孔，再将所述步骤2）中制备的磁珠式人工抗原提呈细胞，按照针对主要组织相容性抗原MHC分子型别和抗原表位的不同加入不同的微量反应孔中，制成磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板；4）抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的检测：取待检机体的血细胞标本，常规分离单个核细胞PBMC，计数后将所述分离的单个核细胞PBMC加入所述步骤3）中制备的磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板的每个微量反应孔中，反应0.5~3小时后，将该磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板置于板式磁块Plate Magnet上，洗涤微量反应孔并倾倒上清液，从而去除未与磁珠结合的细胞；移走板式磁块Plate Magnet后将淋巴细胞培养液加入每个微量反应孔中，在显微镜下计数每个微量反应孔中与磁珠结合的细胞数量，即抗原表位特异性的胸腺依赖性淋巴细胞数量；将磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板置于细胞培养箱培养24~72小时，弃去淋巴细胞培养液后用蒸馏水洗涤每个微量反应孔，破坏细胞，弃除微量反应孔内所有磁珠及细胞碎片，将生物素标记的细胞因子抗体加入微量反应孔中，静置0.5~2小时后洗涤微量反应孔，向每个微量反应孔加入酶标亲和素继续静置0.5~1.5小时，洗涤微量反应孔后加入酶底物显色，用酶标仪检测每个 微量反应孔的吸光度或者用显微镜计数每个微量反应孔中的斑点数，根据所测得的吸光度或斑点数评价特异性胸腺依赖性淋巴细胞接受人工抗原提呈细胞的双信号刺激后活化并分泌细胞因子和颗粒酶B的能力。