[发明专利]一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及一种抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞检测方法。

背景技术

抗原特异性T淋巴细胞是介导适应性免疫应答的核心细胞，在抗感染、抗肿瘤以及超敏反应和自身免疫病的发生中起着至关重要的作用，其数量的多寡和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态，在选择治疗方案、评价药物疗效、预测疾病进程以及疫苗效果监测等方面都有着不同于抗体的重要参考价值。但是，与特异性抗体的检测相比，特异性T细胞的数量和功能检测都困难许多，方法少而复杂，试剂少而昂贵。

T细胞膜上的TCR（T细胞抗原受体）与抗原提呈细胞膜上pMHC分子（MHC/抗原肽复合体）的特异性识别和结合是T细胞特异性的物质基础。pMHC四聚体技术结合流式细胞分析是目前检测抗原特异性T细胞的金标准方法，最具特异性和准确性。由于pMHC单体与TCR的亲和力较低，解离速度快，不能用于特异性T细胞的分析，而研究表明四价的pMHC分子在亲和力和生物效应方面都是最佳的。1996年Altman等将生物素化的pMHC单体分子与荧光标记的链霉亲和素结合，制成pMHC四聚体，能同时与同一T细胞膜上的4个TCR分子结合，增强了与T细胞的结合力。该技术不断发展，至今已成为特异性T细胞的数量检测、功能分析、表位验证以及T细胞靶向治疗等诸多方面的有力工具。

由于pMHC四聚体的制备难度较大，商业产品少而昂贵，另一种特异性较低但试剂易得的检测方法也应用较多，即ELISPOT技术。在细胞培养孔中将待检细胞群与特定抗原共孵育，刺激抗原特异性T细胞活化而分泌IFN-γ等，继而被包被在孔底的抗IFN-γ等抗体捕获，再经酶标抗体染色，根据显色斑点的多少判断抗原特异性T细胞的数量，实际体现的是接受抗原刺激后活化而分泌IFN-γ的细胞数量（包括非T细胞）。该法兼有分析T细胞活化和分泌细胞因子的功能，但抗原特异性较低。细胞因子的胞内荧光染色法也有类似的缺点。

为了既高度特异又简单方便地检测抗原特异性T细胞，人们在两个方面不断地进行探索：一是改进和创新pMHC四聚体或多聚体的制备技术，使工艺简化，成本降低，促进四聚体技术的推广应用。传统的pMHC复合体制备方法是稀释法，即将原核重组表达的MHC I类分子的重链及β2微球蛋白（或MHC II类分子的α链及β链）与人工合成的抗原肽稀释到缓冲液中进行复性折叠，浓缩后再纯化pMHC单体分子，而后经生物素-亲和素系统制备四聚体。主要缺点是步骤繁杂，费时3天，复性效率低于5%，而且需要原核表达不同型别MHC分子的基因工程蛋白。对此，人们不断进行改进，如：2006年，Ruan等建立EBV转化的能表达各型别HLA-A、-B和-C分子的B细胞系，从细胞膜上提取纯化真核表达的α链，再经稀释法与外源性β2和抗原肽进行折叠。受真核表达和操作繁杂的限制，此方法的产量也比较低下。另一种较新颖的改进是条件性抗原肽策略，即将MHC重链、β2和条件性抗原肽以传统稀释法制备成pMHC复合体，然后在紫外线的作用下使条件性抗原肽在特定部位断裂而从复合体中解离，再加载新的目的抗原肽而制成新pMHC复合体。该法虽可更换抗原肽，但制备过程仍很复杂，难以大批量生产。2010和2011年，季明春和Samanta等先后报道了抗原肽-MHC I类分子重链和β2相融合的单链重组蛋白技术，并制备了单链蛋白的四聚体。该技术省去了重链和β2蛋白的体外折叠，但仍需将大分子量的融合蛋白恢复正确的pMHC空间构象以及浓缩、纯化等步骤，复性效率较低。因此，继续发展更加简便和高效的pMHC制备方法仍十分必要。

二是探索基于pMHC分子靶向的T细胞检测的新方法，如pMHC芯片技术。