[发明专利]产中性植酸酶菌株的制备和发酵条件

摘要

本发明所属微生物发酵研究开发领域。本发明涉及产植酸酶菌株的制备和发酵条件：土壤样品稀释到10-4或10-5并均匀涂布到筛选培养基，经复筛得到菌株phy7；phy7经16S rDNA鉴定，得到该菌株的16S rDNA序列长度为1489bp，GenBank登陆号为JN408760，属于绿脓假单胞菌属；该菌株分泌中性植酸酶，其最适反应pH为7.0、最适反应温度为40℃，以植酸钠为底物的Km值为0.26mmol/L，Vmax为0.0506nmol/min；菌株的优化培养基为(g/L)：可溶性淀粉40、胰蛋白胨10、NaNO2：8.6、NH4NO3：5.0、K2HPO4：0.10、KCl：0.10、MgCl2：0.10、MnCl2：0.09，pH6.0。在发酵温度30℃，150r/min，装液量100mL(250ml三角瓶)，接种量7％，发酵24h后酶活最高，为230.2U/mL，比未优化前提高了2.13倍。本发明制备方法简单，操作方便，得到的菌株反应条件温和，酶活高，用途广泛。

主权项

本发明涉及产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，其特征在产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，包括以下过程：步骤(一)：土壤样品稀释到10‑4或10‑5并均匀涂布到筛选培养基，培养3～4d，挑选带透明圈的菌株接种于细菌营养肉汁平板培养基，划线分离；步骤(二)：将步骤(一)单菌落点种于筛选培养基，培养3～4d，选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基，以备复筛和鉴定；步骤(三)：挑取步骤(二)编号为phy7的初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30℃摇振培养3‑5d，提取菌株的总DNA作为模板，利用细菌通用引物进行PCR反应，纯化；步骤(四)：将步骤(三)纯化后的PCR产物送上海生工生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对，通过Mega4.0.2软件计算出序列的系统进化距离，Neighbor‑Joining法构建系统进化树；步骤(五)：挑取步骤(二)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变碳源、氮源、磷源、金属离子的种类，在30‑40℃、150r/min振荡发酵培养20‑24h，分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的4个因子的3个水平，采用L9(34)正交表进行实验分析；步骤(六)：挑取步骤(二)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变发酵温度、培养时间、接种量、培养基初始pH、三角瓶装液量，在30‑40℃、150r/min振荡发酵培养20‑24h分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的3个因子的3个水平，采用L9(33)正交表进行实验分析。