[发明专利]产中性植酸酶菌株的制备和发酵条件

说明书

技术领域

本发明所属微生物发酵研究开发技术领域。本发明涉及产植酸酶菌株的制备和发酵条件的研究，适合发酵工业研究或工业化生产。 

背景技术

植酸是1872年由prefer首先发现的，又名肌醇六磷酸酯，属于有机磷酸酯化合物。为淡黄色或淡褐色浆状液体，几乎不以游离状态存在，在生物体内常以植酸盐的形式存在。它广泛地存在于植物种子中，尤以米糠中含量最高。 

植酸是从植物中或植物加工后剩余物中提取的，对人类健康不会产生不良影响，研究发现它具有广泛的用途，如在食品中有以下几方面的用途：具有抗氧化作用，可与三价Fe鳌合防止豆油氧化、水解，抑制含油脂食品的酸败，所以可用其保存食油；植酸可以吸收微量金属，用于豆油的精炼，使之纯度增加；植酸作为蛋白质凝固剂，用于制作豆腐，加入0.20-0.10％，使之具有独特结构和风味，提高成品率、质量、保存性.在蛋及蛋制品加热过程中，可以消除因发生硫化氢而造成的变黑现象；植酸在腌咸白菜、罗卜时，加入0.1％，使之色泽明亮，质量改善；植酸用于青豆、玉米豆等水煮罐头，具有很强保鲜作用，同时植酸可以防止罐头食品在加热杀菌过程中产生的硫化氢与食物本身存在铁、铜元素及从罐头表面溶解下来的锡等金属结合生成硫化物可导致食品变色；植酸钙可作为葡萄酒发酵期，发泡期的发酵助长剂，善色、香味；植酸在速溶咖啡中能抗浮渣，抗泡沫，还可以增进酱油、豆浆及腌制品风味，防止变色等。 

虽然植酸在食品工业中具有较多作用，但由于人和动物的消化道不能产植酸酶，大量未被利用的植酸磷排入环境，造成水域的富营养化；同时，植酸是一种广谱性的抗营养因子，可与钙、镁、锌、钾等矿物质元素结合成不溶性盐类，而降低了植物的营养和价值，它还可以络合蛋白质，抑制多种消化酶的活性。 

植酸酶(phytase)也称肌醇六磷酸酶(myo-inositolhexaphoshate phosphohydrotase)，它是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或者磷酸盐)一类酶的总称。它分两类，一是3-植酸酶(EC 3.1.3.8)，二是6-植酸酶(EC 3.1.2.6)。它是一种新型、绿色环保的饲料用酶。植酸酶可释放植酸中磷份，提高了人和动物对磷的吸收利用率，减少排泄物中有机磷的含量。目前，对酸性植酸酶研究较多，酸性植酸酶有效作用范围在2.5～5.5之间，所以它仅适用于单胃动物畜禽及少数鱼类如虹鳟等，但不适于消化道为中性的鲤科鱼类。对中性植酸酶目前还缺乏较深入的研究，故我们从土壤筛选出产中性植酸酶的高产菌株，对其进行分 子生物学鉴定，并对其产酶的发酵条件进行了研究。 

发明内容

1.本发明涉及产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，其特征在产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，包括以下过程： 

步骤(一)：土壤样品稀释到10^-4或10^-5并均匀涂布到筛选培养基，培养3～4d，挑选带透明圈的菌株接种于细菌营养肉汁平板培养基，划线分离； 

步骤(二)：将步骤(一)单菌落点种于筛选培养基，培养3～4d，选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基，以备复筛和鉴定； 

步骤(三)：挑取步骤(二)编号为phy7的初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30℃摇振培养3-5d，提取菌株的总DNA作为模板，利用细菌通用引物进行PCR反应，纯化； 

步骤(四)：将步骤(三)纯化后的PCR产物送上海生工生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对，通过Mega4.0.2软件计算出序列的系统进化距离，Neighbor-Joining法构建系统进化树； 

步骤(五)：挑取步骤(二)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变碳源、氮源、磷源、金属离子的种类，在30-40℃、150r/min振荡发酵培养20-24h，分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的4个因子的3个水平，采用L₉(3⁴)正交表进行实验分析； 

步骤(六)：挑取步骤(二)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变发酵温度、培养时间、接种量、培养基初始pH、三角瓶装液量，在30-40℃、150r/min振荡发酵培养20-24h分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的3个因子的3个水平，采用L₉(3³)正交表进行实验分析。