[发明专利]一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法

摘要

本发明提供的一种新的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法，包括（1）MDCK细胞的制备：抽取密度为2.0×106的MDCK冻存细胞1.5ml，置于37℃水浴中，加入10-15ml细胞培养液，培养72小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成4.0×105的MDCK细胞悬液，以40000个/孔(0.1ml/孔)的细胞密度铺到96孔细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时成致密单层备用；（2）重组禽流感H5N1抗原的接种：抽取不同批次重组禽流感H5N1细胞源抗原，分别加入上述的致密单层中，每孔100ul，加细胞维持液100ul，培养至第4天,以细胞病变的孔数，用Reed-Muench法，计算TCID50值。该方法适用于红细胞凝集试验测定病毒含量的细胞源疫苗，即不同的病毒使用对应的敏感细胞。

主权项

一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法，其特征在于：采用MDCK细胞测定重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗病毒抗原TCID50的方法，分步骤实施；其1 MDCK细胞的制备： 抽取密度为2.0×106的MDCK冻存细胞1.5ml，置于37℃水浴中，晃动溶解2‑3分钟，在1000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入10‑15ml细胞培养液，转入75cm2培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中，培养72小时，用浓度0.25%的EDTA‑胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成4.0×105的MDCK细胞悬液，以40000个/孔的细胞密度，0.1ml/孔细胞悬液铺到96孔细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时，成致密单层备用;接种病毒抗原之前弃去细胞营养液，用pH7.2的PBS溶液清洗两遍;其2 重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种：抽取不同批次的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗，用细胞维持液；做10倍的梯度稀释，取10‑3‑10‑7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔100ul；同时设对照每孔加细胞维持液；100ul，放入37℃、5％的CO2培养箱中，培养至第4天，计算TCID50值；其3红细胞凝集，计算TCID50值： 将病变后的96孔板按照原有顺序，每孔吸取培养液25‑50ul，置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25‑50ul1%红细胞悬液，在微量板振荡器上摇匀，其温度20～30℃,时间15～30分钟，其中100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，依据Reed‑Muench法，获得精准的TCID50值；上述细胞营养液由13.54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清100ml而成；上述细胞维持液由13.54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其终浓度为2ug/mlTPCK；上述1%红细胞悬液取SPF鸡血液，与等量阿氏液混合，在1500r/min下离心10分钟，用0.85%生理盐水离心洗涤3‑4次，每次1500r/min，离心10分钟，将沉积的红细胞用0.85%生理盐水制成1%悬液。