[发明专利]一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及采用MDCK细胞（犬肾细胞）毒含量测定，联合红细胞凝集试验，对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量实施测定，降低主观判断误差，具有重要的应用价值。

背景技术

由于现行的禽流感H5N1灭活疫苗主要是在鸡胚上进行培养，收获尿囊液，灭活后制备成成品疫苗，其抗原的病毒含量是用鸡胚半数感染量和血凝价进行检测，但用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异，而且鸡胚残留物还可引起过敏性反应，鸡胚作为疫苗生产基质，还存在大规模生产时供给和潜在外源病毒污染问题，因此，细胞疫苗技术成为目前值得发展的新兴技术。而传统的细胞源疫苗仅用细胞病毒含量测定方法，但常常出现细胞阴性对照在判读时已有大量细胞圆缩，已起不到对照的作用，或者有些细胞病变不明显而观察不到等，出现主观错误。

文献检索披露：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘明等人进行了重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究，文章未涉及对禽流感鸡胚毒在MDCK细胞上的驯化。

本发明构思是将病毒抗原接种在MDCK细胞进行病毒含量测定,为了防止观察细胞病变时出现主观错误，又引入红细胞凝集试验，100%红细胞凝集的孔即与细胞病变的孔相对应, 100%红细胞凝集的孔数根据Reed-Muench法计算TCID₅₀；与传统的方法比较，该方法更为客观和准确，大大降低了主观判断的误差。

发明内容

本发明的目的在于：提供的测定方法，即建立用MDCK细胞联合红细胞凝集试验对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法，使病毒含量测定更准确、更客观。

本发明的目的是这样实现的：一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法，采用MDCK细胞测定重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗病毒抗原TCID₅₀的方法，分步骤实施：

其1 MDCK细胞的制备： 

抽取密度为2.0×10⁶的MDCK冻存细胞1.5ml，置于37℃水浴中，晃动溶解2-3分钟，在1000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入10-15ml细胞培养液，转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5%的CO₂培养箱中，培养72小时，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化液，再用细胞营养液稀释成4.0×10⁵的MDCK细胞悬液，以40000个/孔的细胞密度，0.1ml/孔细胞悬液铺到96孔细胞板上，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养，培养24小时，成致密单层备用;接种病毒抗原之前弃去细胞营养液，用pH7.2的PBS溶液清洗两遍;

其2 重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种：

抽取不同批次的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗，用细胞维持液；做10倍的梯度稀释，取10^-3-10^-7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔100ul；同时设对照每孔加细胞维持液；100ul，放入37℃、5％的CO₂培养箱中，培养至第4天，计算TCID₅₀值；

其3红细胞凝集，计算TCID₅₀值： 

将病变后的96孔板按照原有顺序，每孔吸取培养液25-50ul，置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25-50ul1%红细胞悬液，在微量板振荡器上摇匀，其温度20～30℃,时间15～30分钟，其中100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，依据Reed-Muench法，获得TCID₅₀值；

上述细胞营养液由13.54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清100ml而成；

上述细胞维持液由13.54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其终浓度为2ug/mlTPCK；

上述1%红细胞悬液取2-4只2-6月龄SPF鸡血液，与等量阿氏液混合，在1500r/min下离心10分钟，用0.85%生理盐水离心洗涤3-4次，每次1500r/min，离心10分钟，将沉积的红细胞用0.85%生理盐水制成1%悬液。