[发明专利]确定病毒RNA分子3’末端序列的方法

摘要

一种确定病毒RNA分子3’末端序列的方法，包括提取病毒RNA、加尾病毒RNA的纯化、加尾病毒RNA的逆转录反应、病毒逆转录产物的聚合酶链式反应扩增步骤。病毒RNA的末端转移反应本发明通过末端转移反应加尾后，可利用逆转录反应准确地确定病毒RNA分子的3’末端序列，方便快捷。由于可以使用Oligo dT或是修饰的Oligo dT引物进行逆转录反应，省去了针对某一特定病毒RNA分子设计及合成特异性引物的过程，使得实验周期大大简化，并且节约了实验成本。同时，本发明也可以应用于其他3’末端不具有PolyA尾结构的RNA分子的3’末端序列的确定。

主权项

一种确定病毒RNA分子3’末端序列的方法，包括下述步骤：(1)提取病毒RNA用常规方法提取病毒RNA，检测获得病毒RNA的质量，将病毒RNA的浓度定量至1μg/μL；(2)病毒RNA的末端转移反应向离心管中加入病毒RNA、浓度为10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、焦碳酸二乙酯处理水至12.5μL，10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸与焦碳酸二乙酯处理水、病毒RNA的体积比为1∶4∶7.5，混匀，70℃温育15分钟使病毒RNA变性，获得变性病毒RNA溶液，置于冰上2～10分钟，向含有变性病毒RNA溶液的离心管内加入末端转移酶缓冲液、浓度为20U/μL的末端转移酶、浓度为40U/μL的RNA酶抑制剂，总体积20μL，20U/μL的末端转移酶与40U/μL的RNA酶抑制剂、末端转移酶缓冲液、病毒变性RNA溶液的体积比为1∶1.3∶2.7∶8.3，混匀，37℃温育60分钟，70℃温育10分钟失活末端转移酶，终止反应，即在病毒RNA分子的3’末端连接上至少10～50个寡聚A脱氧核苷酸，得到加尾病毒RNA溶液；(3)加尾病毒RNA的纯化向含有加尾病毒RNA溶液的离心管中加入30μL焦碳酸二乙酯处理水。依次加入浓度为3mol/L pH为5.2的醋酸钠溶液、浓度为5mg/mL的核酸共沉剂、无水乙醇，5mg/mL的核酸共沉剂与3mol/L pH为5.2的醋酸钠溶液、加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水、无水乙醇的体积比为1∶1.25∶5∶7.5∶25，混匀，4℃12000转/分钟离心35分钟，用4℃预冷的75％乙醇洗盐，4℃12000转/分钟离心5分钟，弃去上清，待乙醇挥发干净，加入20μL焦碳酸二乙酯处理水溶解加尾病毒RNA，得到纯化后的加尾病毒RNA溶液；(4)加尾病毒RNA的逆转录反应向离心管中加入纯化后的加尾病毒RNA溶液、浓度为Oligo dT引物或修饰的Oligo dT引物，焦碳酸二乙酯处理水至10μL，Oligo dT引物或修饰的Oligo dT引物与纯化后的加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的体积比为1∶3∶6，混匀，将离心管于70℃温育10分钟对纯化后的加尾病毒RNA溶液进行变性，置于冰上冷却2～10分钟，向含有变性的加尾病毒RNA溶液的离心管内加入一链缓冲液、浓度为0.1mol/L的二硫苏糖醇、浓度为10mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、浓度为200U/μL的逆转录酶、浓度为40U/μL的RNA酶抑制剂，200U/μL的逆转录酶与40U/μL的RNA酶抑制剂、0.1mol/L的二硫苏糖醇、10mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾病毒RNA溶液的体积比为1∶1∶2∶2∶4∶10，混匀后50℃温育60分钟，70℃温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得病毒逆转录产物；(5)病毒逆转录产物的聚合酶链式反应扩增向离心管中加入病毒逆转录产物、DNA聚合酶缓冲液、浓度为10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、浓度为10mmol/L的上游引物、浓度为10mmol/L Oligo dT引物或UAP引物、浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶、无菌水，总体积20μL，UAP引物与修饰的Oligo dT引物的5’末端核苷酸序列一致，DNA聚合酶缓冲液与10mmol/L的上游引物、10mmol/L的Oligo dT引物或UAP引物、5U/μL的Taq DNA聚合酶、10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、逆转录产物、无菌水的体积比为1∶0.1～0.3∶0.1～0.3∶0.05～0.25∶0.4～1∶0.5～1.5∶5.7～7.9，混匀，按照常规方法进行聚合酶链式反应，得聚合酶链式反应产物。