[发明专利]确定病毒RNA分子3’末端序列的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种快速、准确地确定病毒RNA分子3’末端序列的方法。

背景技术

病毒是由核酸和蛋白质构成的非细胞型生物，严格的细胞内寄生，利用宿主的酶系统进行复制。依靠这种机制，病毒可以导致持续性感染的发生，或是导致细胞的转化，形成肿瘤。目前对病毒的研究主要集中在三个方面：一方面是为了有效地防治和控制各种病毒性疾病的发生和流行；另一方面是通过对病毒的的认识进一步了解生命物质的基本问题；第三个方面是利用病毒造福人类。但无论哪一个方面，对病毒遗传物质的研究都显得格外重要。

一种病毒只有一种特定类型的核酸，即脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。对于DNA病毒，目前多利用聚合酶链式反应实现体外病毒DNA序列的大量扩增，从而可以对病毒DNA基因组进行测序、分析等相关工作，了解病毒的遗传信息。在研究RNA病毒时，同样需要对RNA病毒基因组的序列进行测定。但聚合酶链式反应只能扩增DNA链，不能直接扩增RNA链。因此通常情况下，需要将病毒RNA逆转录为与之相对应的cDNA第一链，再通过聚合酶链式反应克隆逆转录产物，测定cDNA序列来获得相应的病毒RNA的序列。某些RNA病毒的基因组同真核细胞的信使RNA(mRNA)一样，其分子3’末端具有多聚A尾(polyA)结构，一般为40～200个多聚A核苷酸。由此，可以利用这一特性设计逆转录引物，常用寡聚T核苷酸Oligo dT引物或是修饰的Oligo dT引物(在Oligo dT的5’末端增加一段核苷酸序列)，通过Oligo dT与病毒RNA3’端的polyA相配对完成逆转录反应。经过聚合酶链式反应扩增、序列测定后可以推测出这些RNA病毒基因组3’端的序列。但是其他RNA病毒基因组3’端是不具有polyA结构的，对于这些病毒RNA序列则无法直接使用Oligo dT引物或是修饰的Oligo dT引物进行逆转录。传统的方法是利用随机引物与病毒RNA分子3’端结合进行逆转录反应。由于随机引物只能与病毒RNA分子3’端随机结合并向病毒RNA分子5’端方向延伸，因此这种方法只能准确定位到病毒RNA分子的5’末端，从而获得病毒RNA分子的5’末端序列。而病毒RNA分子的3’端由于是与随机引物相结合(不一定能结合到3’末端)，因此无法准确定位，想要获得病毒RNA分子3’端的序列则相对困难。

末端转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合至DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为末端转移酶的底物。此外末端转移酶还有催化脱氧核苷酸结合至RNA分子3’羟基端的活性。因此利用末端转移酶的这一特性，在病毒RNA分子3’末端加上10～50个寡聚A脱氧核苷酸，将一般的病毒RNA加工为3’端具有polyA尾的RNA与DNA的杂合分子，再用Oligo dT或修饰的Oligo dT引物进行逆转录反应，则可准确获得该病毒RNA分子3’端的序列。

除了信使RNA，RNA还以核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、不均一核RNA(hnRNA)和小核RNA(snRNA)等形式存在，他们都各自承担着重要的生物学功能。由于少数信使RNA和其他类型的RNA分子是不具有polyA结构的，对于这些RNA的序列同样无法直接通过利用Oligo dT引物或是修饰的Oligo dT引物进行逆转录的方法来得到。因此，一样可以采用末端转移酶在RNA分子3’末端加上10～50个寡聚A脱氧核苷酸的方法，将一般的RNA加工为3’端具有PolyA尾的RNA与DNA的杂合分子，然后再用Oligo dT或修饰的Oligo dT引物进行逆转录反应，就可以准确地获得该RNA分子3’端的序列。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺点，提供了一种能够快速、准确的确定病毒RNA分子3’末端序列的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案包括下述步骤：

1、提取病毒RNA

用常规方法提取病毒RNA，检测获得病毒RNA的质量，将病毒RNA的浓度定量至1μg/μL。

2、病毒RNA的末端转移反应