[发明专利]确定人APRIL基因启动子、转录因子结合位点的方法及用途

摘要

本发明公开了一种确定人APRIL基因启动子、转录因子结合位点的方法及用途，本发明克隆并鉴定了APRIL的启动子区域。发现-1539到-1001的区域对APRIL的转录调控具有重要的作用；这一区域内存在转录因子Sp1或NF-kB，并且能激活APRIL基因的转录。本发明提供了光辉霉素和Bay11-7082在制备治疗人结直肠癌的药物中的应用，效果确切。

主权项

一种确定人APRIL基因启动子、转录因子结合位点的方法，其特征是：包括下列步骤：（1）结构分析APRIL启动子区域用生物信息学软件分析APRIL基因5’侧翼区的3500bp的基因序列，发现‑1899到+103的区域是APRIL的潜在启动子区域，PromoterScan软件分析发现‑1889 到 ‑1639 和 ‑968 到‑718 是潜在的启动子区域，CpG Island 分析发现CpG 岛位于‑222到‑15区域，APRIL的5’侧翼区含有大量的GC 和CpG 岛；（2）扩增APRIL启动子区域和构建荧光素酶报告质粒采用单向缺失方法来分析APRIL 5’侧翼区的2003个碱基，平截片段的5末端从‑1889到‑222，3’末端是+103， APRIL的4个平截片段由PCR从人基因组DNA上扩增得到，每个PCR产物的长度分别是2003bp, 1643bp, 1105bp and 407bp，然后PCR产物用限制性内切酶MluI 和HindIII进行双酶切，并连接到无启动子活性的荧光素酶报告质粒pGL3‑Basic上；把质粒与PCR产物组成的重组产物分别命名为APRIL‑1889, APRIL‑1539, APRIL‑1001, APRIL‑304，重组产物通过酶切和DNA测序进行验证；（3）功能性鉴定APRIL 启动子区域为了鉴定哪一个片段对APRIL基因的转录调节有作用，将这4个重组产物瞬时转染到人结直肠癌SW480细胞和HT29细胞中；质粒pGl4.74作为内参，转染48小时后，将细胞提取物用于荧光素酶活性分析，在SW480细胞APRIL‑1539在所有的重组产物中表现出最强的荧光素酶活性，APRIL‑1001 和APRIL‑304启动子的活性低于APRIL‑1539，APRIL‑1889的活性最低，在HT‑29细胞中具有相似的结果；再用TFSEARCH 软件来寻找该区域潜在的转录因子结合位点， 分析发现两个重要的顺式作用元件，NF‑kB位于‑1023 to ‑1032，和Sp1位于‑1029 to ‑1038；（4）Sp1和NF‑kB结合APRIL启动子区域用EMSA电泳迁移位移试验来观察Sp1和 NF‑kB是否结合APRIL基因的核心启动子区的潜在转录因子结合位点，生物素标记探针与SW480细胞核提取物在室温下孵育20分钟后，观察到NF‑Kb和Sp1生物素标记探针与SW480 DNA核蛋白相互反应产生的DNA蛋白复合体，核蛋白与探针的相互作用，能分别被NF‑Kb和Sp1的冷凝探针竞争掉，说明转录因子与其结合位点的结合是特异性的；（5）转录因子NF‑kB 和Sp1与APRIL启动子之间的相互作用为了检测转录因子NF‑kB 和 Sp1对APRIL调节的影响，分别将不同量的pcDNA3.1/p65或pCMV‑HA/Sp1与荧光素酶报告质粒APRIL‑538转染SW480细胞，538表示APRIL基因从‑1539 到‑1001的序列长度，转染48小时后，检测荧光素酶活性，过表达NF‑kB 或Sp1后，APRIL启动子的活性明显升高，结果说明转录因子NF‑kB 和 Sp1 能通过APRIL‑538上的转录因子结合位点激活APRIL的转录。