[发明专利]确定人APRIL基因启动子、转录因子结合位点的方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种确定人APRIL基因启动子、转录因子结合位点的方法及用途。

背景技术

在世界范围内，结直肠癌在癌症引起死亡病例中排第三位。近几年，结直肠癌在亚洲和东欧国家的发病率呈上升趋势。APRIL在1998年克隆并鉴定。APRIL除了在结直肠癌和淋巴瘤和黑色素瘤细胞细胞高表达之外，在别的组织中表达水平很低，说明APRIL具有组织特异性。前面的研究发现，与其周围的正常组织相比，APRIL在结直肠癌细胞株SW480中高表达。我们实验室的研究也发现APRIL在结直肠癌SW480细胞中高表达。此外将APRIL干扰质粒转染到SW480结直肠癌裸鼠模型中，裸鼠体内的的肿瘤明显减少。以上说明APRIL在结直肠癌的的发生发展中具有重要的作用。因此，了解APRIL的转录调节机制对结直肠癌的治疗具有重要的作用。

人APRIL基因定位于染色体17p13.1，与小鼠11号染色体上的位置相似。APRIL是一个典型的跨膜蛋白，N端在内，C端在外。它是肿瘤坏死因子家族的一名成员。它通过肿瘤坏死因子的同源区域与含有半胱氨酸富集区的受体相结合。它有三个受体B细胞成熟抗原、穿膜蛋白活化物、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。APRIL与B细胞成熟抗原和穿膜蛋白活化物结合能激活经典的NF-kB途径，NF-kB途径在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。APRIL和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合能促进有APRIL诱导产生的肿瘤的生长。然而到，到底是哪一个受体对APRIL信号通路有直接的作用，到现在还不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法简单、准确的确定人APRIL基因启动子、转录因子结合位点的方法。

本发明的目的还在于提供一种光辉霉素和Bay11-7082在制备治疗人结直肠癌的药物中的应用。

本发明的技术解决方案是：

一种确定人APRIL基因启动子、转录因子结合位点的方法，其特征是：包括下列步骤：

(1)结构分析APRIL启动子区域

用生物信息学软件分析APRIL基因5’侧翼区的3500bp的基因序列，发现-1899到+103的区域是APRIL的潜在启动子区域，PromoterScan软件分析发现-1889到-1639和-968到-718是潜在的启动子区域，CpG Island分析发现CpG岛位于-222到-15区域，APRIL的5’侧翼区含有大量的GC和CpG岛；

(2)扩增APRIL启动子区域和构建荧光素酶报告质粒

采用单向缺失方法来分析APRIL 5’侧翼区的2003个碱基，平截片段的5末端从-1889到-222，3’末端是+103，APRIL的4个平截片段由PCR从人基因组DNA上扩增得到，每个PCR产物的长度分别是2003bp，1643bp，1105bp and 407bp，然后PCR产物用限制性内切酶MluI和HindIII进行双酶切，并连接到无启动子活性的荧光素酶报告质粒pGL3-Basic上；把质粒与PCR产物组成的重组产物分别命名为APRIL-1889，APRIL-1539，APRIL-1001，APRIL-304，重组产物通过酶切和DNA测序进行验证；

(3)功能性鉴定APRIL启动子区域

为了鉴定哪一个片段对APRIL基因的转录调节有作用，将这4个重组产物瞬时转染到人结直肠癌SW480细胞和HT29细胞中。质粒pGl4.74作为内参，转染48小时后，将细胞提取物用于荧光素酶活性分析，在SW480细胞APRIL-1539在所有的重组产物中表现出最强的荧光素酶活性，APRIL-1001和APRIL-304启动子的活性低于APRIL-1539，APRIL-1889的活性最低，在HT-29细胞中具有相似的结果；再用TFSEARCH软件来寻找该区域潜在的转录因子结合位点，分析发现两个重要的顺式作用元件，NF-kB位于-1023to-1032，和Sp1位于-1029to-1038；

(4)Sp1和NF-kB结合APRIL启动子区域

用EMSA电泳迁移位移试验来观察Sp1和NF-kB是否结合APRIL基因的核心启动子区的潜在转录因子结合位点，生物素标记探针与SW480细胞核提取物在室温下孵育20分钟后，观察到NF-Kb和Sp1生物素标记探针与SW480DNA核蛋白相互反应产生的DNA蛋白复合体，核蛋白与探针的相互作用，能分别被NF-Kb和Sp1的冷凝探针竞争掉，说明转录因子与其结合位点的结合是特异性的；

(5)转录因子NF-kB和Sp1与APRIL启动子之间的相互作用