[发明专利]人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法

摘要

本发明提出一种人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，从人胚中脑中分离培养并鉴定神经干细胞。其包括步骤原代中脑神经干细胞的分离培养、原代细胞的传代培养、细胞诱导分化、免疫细胞化学染色以及细胞计数。本发明利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚皮层中分离具有单细胞克隆能力的细胞，并进行培养、传代，贴壁分化观察，采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。

主权项

一种人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，所述方法包括以下步骤：S1：原代中脑神经干细胞的分离培养：取胚龄10～13周水囊引产的新鲜人胚胎，在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含B27(1∶50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/F12(1∶1)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整活细胞浓度为1×105/ml，将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37℃，5％CO2条件下静置培养；S2：原代细胞的传代培养：原代克隆形成后用0.25％胰酶37℃消化15～30min或采用机械切割分离或吹打，制成单细胞悬液，用含B27和EGF、bFGF的无血清培养基将细胞悬液按1×106/ml浓度传代接种于培养瓶，在37℃，5％CO2条件下静置培养，直至次代克隆球的产生；平均5～7天传代一次；S3：细胞诱导分化：将不同代数的神经球体外培养7天后种植入多聚赖氨酸包被的含胎牛血清培养基(DMEM/F12+B27+10％FBS)培养皿中，体外3h，10d，14d进行免疫细胞化学染色；S4：免疫细胞化学染色；以及S5：细胞计数。