[发明专利]人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法

权利要求书

1.一种人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，所述方法包括以下步骤：

S1：原代中脑神经干细胞的分离培养：取胚龄10～13周水囊引产的新鲜人胚胎，在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含B27(1∶50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/F12(1∶1)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整活细胞浓度为1×10⁵/ml，将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37℃，5％CO₂条件下静置培养；

S2：原代细胞的传代培养：原代克隆形成后用0.25％胰酶37℃消化15～30min或采用机械切割分离或吹打，制成单细胞悬液，用含B27和EGF、bFGF的无血清培养基将细胞悬液按1×106/ml浓度传代接种于培养瓶，在37℃，5％CO₂条件下静置培养，直至次代克隆球的产生；平均5～7天传代一次；

S3：细胞诱导分化：将不同代数的神经球体外培养7天后种植入多聚赖氨酸包被的含胎牛血清培养基(DMEM/F12+B27+10％FBS)培养皿中，体外3h，10d，14d进行免疫细胞化学染色；

S4：免疫细胞化学染色；以及

S5：细胞计数。

2.一如权利要求1所述的人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，所述免疫细胞化学染色方法包括：

1、以间接免疫荧光法检测刚贴壁3h神经球中神经巢蛋白(Nestin蛋白)表达，及检测神经球体外分化14天后，分化细胞中神经微丝(NFneurofilament)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Galc(半乳糖脑苷)的表达；所用一抗为抗NestinIgG、抗NF IgG、抗GFAP IgG、抗Galc IgG，二抗为FITC荧光二抗；

2、用SABC组织化学染色试剂盒检测在神经球分化10天后，分化细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达；SABC法细胞染色具体染色步骤参照染色试剂盒说明。