[发明专利]一种海蜇小分子糖肽的制备方法

摘要

一种海蜇小分子糖肽的制备方法，新鲜海蜇绞碎后的组织捣碎液中加入氯化钠溶液提取，然后用中空纤维素薄膜浓缩，然后加入乙醇沉淀得到粗糖蛋白，然后用DEAE纤维素离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化，收集洗脱液冻干得到纯化的海蜇糖蛋白，再用复合蛋白酶酶解得到糖肽溶液，糖肽溶液超滤后的滤液冻干得到海蜇小分子糖肽。与传统的酶法从生物体内直接获得糖肽比较，本发明避免生成物其它组分对酶活性的影响，直接准确地作用于糖蛋白，可以充分发挥酶的活性，获得小分子的糖肽。本发明获得的小分子量糖肽，能够进行质谱分析，因此对糖蛋白结构解析十分重要。

主权项

一种海蜇小分子糖肽的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：1）海蜇糖蛋白的提取：用组织捣碎机将新鲜海蜇绞碎，称取组织捣碎液，按每克组织捣碎液加入4ml浓度为 0.5mol/L的 NaCl溶液的比例加入NaCl溶液混合均匀，在10℃的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4℃、离心转速为4000r/min的条件下离心20min，取上清液，备用；2）将步骤1中的上清液用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置2h，在温度为4℃、离心转速为10000r/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干即为粗糖蛋白，备用；3）使用DEAE‑52纤维素柱层析，所用层析柱规格为1.6×40cm，内填物为DEAE‑52纤维素，具体步骤为：取步骤2）中制得的粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为1mol/LNaCl溶液进行连续梯度洗脱，流速为0.5ml/min，每管收集2.5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白，备用；4）使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6×60cm，内填物为Blue‑Sepharose 6FF，具体步骤为：取步骤3）中得到的初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为0.5ml/min，每管收集2.5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，然后隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，得白色絮状的糖蛋白，备用；5）海蜇糖蛋白的酶解：取步骤4）中的糖蛋白溶入蒸馏水中制成质量浓度为0.1mg/mL的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0.3‑0.7%，在pH8.0、温度65℃的条件下酶解1‑2h，制得糖肽溶液，备用；6）糖肽分级：采用超滤的方法，对步骤5）获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽。