[发明专利]一种海蜇小分子糖肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖肽的制备方法，具体的说是一种海蜇小分子糖肽的制备方法。

背景技术

海蜇是一种医食同源的大型食用水母，具有较高的营养价值和药用价值。海蜇低糖低脂高蛋白，所以是一种天然保健食品。现代医学研究表明：海蜇具有降血压、降血脂、预防动脉粥样硬化、美容护肤等功效。由于海蜇含水量高，易自溶等特点，因此对其研究前期主要集中在毒素方面。但随着科学技术和现代仪器分析手段的不断进步，对于海蜇体内活性成分的研究越来越多，如毒素、多糖、糖胺聚糖、胶原蛋白、胶原多肽、糖蛋白等，并对他们的生物活性进行深入研究。但关于海蜇糖肽的研究未见报道。

海蜇体内含糖量较低，大部分与糖蛋白结合在一起以糖蛋白的形式存在。目前，从生物体制备糖肽的方法，主要通过直接酶提取的方法，例如，专利01138079.9草栽灵芝多糖肽及其提取方法，首先对草栽灵芝产生子实体进行清洗、干燥、破碎；然后用乙醇回流后热水提取，将提取液浓缩，乙醇沉淀即获得粗糖肽。专利89105471.5一种云芝糖肽（PSP）的生产方法，也是采用热水浸提和醇析的方法，获得糖肽。以上方法获得的糖肽分子量较大，一般在1～10×10⁴Da以上，对于糖肽结构进一步研究十分不利。

发明内容

为解决现有技术提取的糖肽分子量较大，对糖肽结构的进一步研究不利的问题，本发明提供了一种海蜇小分子糖肽的制备方法。

本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为：一种海蜇小分子糖肽的制备方法，包含以下步骤：

1）海蜇糖蛋白的提取：用组织捣碎机将新鲜海蜇绞碎，称取组织捣碎液，按每克组织捣碎液加入4ml浓度为 0.5mol/L的 NaCl溶液的比例加入NaCl溶液混合均匀，在10℃的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4℃、离心转速为4000r/min的条件下离心20min，取上清液，备用；

2）将步骤1中的上清液用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置2h，在温度为4℃、离心转速为10000r/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干即为粗糖蛋白，备用；

3）使用DEAE-52纤维素柱层析，所用层析柱规格为1.6×40cm，内填物为DEAE-52纤维素，具体步骤为：

取步骤2）中制得的粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为1mol/LNaCl溶液进行连续梯度洗脱，流速为0.5ml/min，每管收集2.5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白，备用；

4）使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6×60cm，内填物为Blue-Sepharose 6FF，具体步骤为：

取步骤3）中得到的初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为0.5ml/min，每管收集2.5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，然后隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，得白色絮状的糖蛋白，备用；

5）海蜇糖蛋白的酶解：取步骤4）中的糖蛋白溶入蒸馏水中制成质量浓度为0.1mg/mL的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0.3-0.7%，在pH8.0、温度65℃的条件下酶解1-2h，制得糖肽溶液，备用；

6）糖肽分级：采用超滤的方法，对步骤5）获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽。

本发明所述的冻干操作为常规操作，可在任意型号的冻干机中进行。

本发明所用到的复合蛋白酶为市售的常规蛋白水解酶。

有益效果：本发明先从新鲜海蜇原料里提取糖蛋白，然后对粗糖蛋白进行分离纯化，获得目标糖蛋白后，采用酶解技术进行酶解，最终获得分子量较小的糖肽。与传统的酶法从生物体内直接获得糖肽比较，本发明避免生成物其它组分对酶活性的影响，直接准确地作用于糖蛋白，可以充分发挥酶的活性，获得小分子的糖肽，在进行糖肽或糖蛋白结构分析时，必须用到质谱，而质谱只能检测分子量较小的物质，本发明获得的小分子量糖肽，能够进行质谱分析，因此对糖蛋白结构解析十分重要。

具体实施方式