[发明专利]一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法

摘要

本发明提供了一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，由提取菌种、感染、取材、悬液制备、扩大培养、计数、灭活、合成、稀释、分装、检验十一个步骤组成，所制备的乌鳢腹水病疫苗由费氏枸缘酸杆菌，再加入适量双抗及防腐剂组成，本发明成本低廉，操作方便，可有效提高乌鳢免疫力，防治乌鳢腹水疾病发生。本发明的乌鳢腹水病疫苗，使用方法简便，安全无毒性，对养殖场乌鳢养殖有免疫保护作用，能提高乌鳢养殖成活率，对发生乌鳢腹水病有很好预防效果。

主权项

一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)、提取菌种：从患有明显腹水病症状的乌鳢肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌费氏枸缘酸杆菌，立即放入4‑8℃的冰箱中保存；(2)、感染：将分离的病原菌接种于健康的乌鳢体内，在室内进行感染试验，每只乌鳢接种的病原菌数为1×109‑2×109个 ，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；将分离的病原菌倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到5×109cfu/ml；(3)、取材：取上述乌鳢发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85%生理盐水9‑11毫升10，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成9%‑10%浓度的组织悬液，将制得的组织悬液直接置于‑30℃～‑40℃低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10%加入50%的磷酸缓冲甘油，将其置4‑8℃的冰箱中保存；(4)、悬液制备：将步骤（3）分离出的致病菌费氏枸缘酸杆菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24‑48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成细菌分布均匀的悬液；(5)、扩大培养：取单个菌落在25‑30℃条件下培养48‑72小时，振荡使培养斜面上的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理；(6)、灭活：将扩大培养结束的费氏枸缘酸杆菌悬液摇匀， 放入60‑70℃恒温水浴1.5‑2.5小时灭活或32℃恒温水浴中70‑73小时灭活，即制成灭活疫苗；(7)、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30‑40分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量得青霉素、链霉素和浓度为10％ 的福尔马林溶液，并摇匀，其中，每10毫升上清液中加入青霉素 7500‑8500单位 、链霉素7500‑8500单位， 10％浓度的福尔马林溶液0.1‑0.12毫升；（8）、稀释：用0.85％的无菌盐水稀释灭活菌液至浓度为5×109cfu/ml ； （9）、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4‑8℃冰箱中保存备用；（10）、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求，灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100%，免疫保护率达到80%以上；（11）、检验合格后的灭活菌液，继续置于4‑8℃冰箱中保存备用。