[发明专利]一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖病害防治领域，具体涉及一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法。

背景技术

乌鳢属鲈形目、鳢科，俗称乌鱼、才鱼、黑鱼等，是以鱼类为食的经济价值和营养价值较高的淡水名贵鱼类。乌鳢骨刺少，含肉率高，而且营养丰富，据测定，每100g乌鳢肉含蛋白质19.8g，脂肪1.49g，碳水化合物1.2g，并富含人体所需的钙、磷、铁、锌等营养元素。乌鳢还具有祛湿治病，祛痰生新，通气消肿，活血滋补，生肌补血等药用功效。因此，乌鳢历来深受东南亚各国和港、澳市场的欢迎，是我国外贸出口的重要水产品之一。当前随着乌鳢养殖规模的扩大，集约化养殖程度的提高，其病害的危害也越来越大，其危害程度有加剧趋势，其常见病有：水霉病、腐皮病、烂鳃病、腹水病、出血病、小瓜虫病、红线虫病等，特别是乌鳢腹水病(Ascitesosis of China snakehead)传染性强，发病率高、死亡率最高，可造成鱼种、成鱼大量死亡，给养殖户造成较大经济损失。其病原体是费氏枸缘酸杆菌(Gitrobacter freundii)，是该菌广泛分布于自然界，是人和动物肠道的正常菌落，是机会致病菌，皮肤和肠道是腹水病病原菌的侵入门户。当皮肤受伤可使病原菌侵入机体而发病。引起外伤的主要原因有网捞损伤和寄生虫寄生损伤等。另外，由于投喂变质饵料，乌鳢摄食后，导致肠道内正常菌落失调，为病原菌入侵创造了机会。

近几年来，国产、进口的药物对乌鳢腹水病均无明显疗效或成本太高，效果不明显。只能通过免疫的途径进行预防，而这种疫苗目前在还是空白。

发明内容

本发明提供了一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，本发明成本低廉，操作方便，可有效提高乌鳢免疫力，防治乌鳢腹水疾病发生。

本发明是通过下面的技术方案来实现的。

一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)、提取菌种：从患有明显腹水病症状的乌鳢肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌费氏枸缘酸杆菌，立即放入4-8℃的冰箱中保存；

(2)、感染：将分离的病原菌接种于健康的乌鳢体内，在室内进行感染试验，每只乌鳢接种的病原菌数为1×10⁹-2×10⁹个，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；将分离的病原菌倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到5×10⁹cfu/ml；

(3)、取材：取上述乌鳢发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85％生理盐水9-11毫升10，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成9％-10％浓度的组织悬液，将制得的组织悬液直接置于-30℃～-40℃低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10％加入50％的磷酸缓冲甘油，将其置4-8℃的冰箱中保存。

(4)、悬液制备：将步骤(3)分离出的致病菌费氏枸缘酸杆菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24-48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成细菌分布均匀的悬液；

(5)、扩大培养：取单个菌落在25-30℃条件下培养48-72小时，振荡使培养斜面上的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理；

(6)、灭活：将扩大培养结束的费氏枸缘酸杆菌悬液摇匀，放入60-70℃恒温水浴1.5-2.5小时灭活或32℃恒温水浴中70-73小时灭活，即制成灭活疫苗；

(7)、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30-40分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量得青霉素、链霉素和浓度为10％的福尔马林溶液，并摇匀，其中，每10毫升上清液中加入青霉素7500-8500单位、链霉素7500-8500单位，10％浓度的福尔马林溶液0.1-0.12毫升；

(8)、稀释：用0.85％的无菌盐水稀释至灭活菌液浓度为5×10⁹cfu/ml；

(9)、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4-8℃冰箱中保存备用；

(10)、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求，灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100％，免疫保护率达到80％以上；

(11)、检验合格后的灭活菌液，继续置于4-8℃冰箱中保存备用。

步骤(7)合成时，每10毫升上清液中加入青霉素8000单位、链霉素8000单位，10％浓度的福尔马林溶液0.1毫升。