[发明专利]分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法

摘要

L型钙通道主要分布于心脏，血管，内分泌以及神经系统，在心脏和平滑肌兴奋-收缩偶联，窦房结和房室结的动作电位传导中发挥着极其重要的作用。通过膜片钳记录方法观察化合物对L型钙通道的影响以评价该化合物的心脏安全系数以及治疗高血压的效果已成为重要的研究方式。本发明的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，通过改良灌流液，保存方式以提高分离豚鼠心室肌细胞的收获率和成活率，延长细胞的稳定时间从而提高了实验的成功率和稳定性。

主权项

一种分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将豚鼠猛击头部致昏迷后，开胸快速取出心脏；B、将豚鼠心脏置于4℃的正常台氏溶液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管，置于Langendorff装置上保持温度37℃以8‑10ml/min的速度进行离体心脏灌流：先以正常台氏溶液灌流5min，完全冲洗心脏内残留的血液，再用无钙台氏溶液灌流5min，至心脏完全停止搏动，再用50ml酶解液循环灌流8‑10min，至心脏流出液拉丝明显，膨胀变大，颜色变淡时，再用Kraft‑Brühe溶液灌流5min；C、将心脏从Langendorff装置上取下，剪去心房和基底部组织，将心室肌组织剪成1.5‑2.5mm碎块，用粗开口吸管缓慢吹打使心室肌细胞从心肌碎块上分离；D、将分离出的心室肌细胞置于37℃水浴锅中振荡1‑2min，得到细胞混悬液；E、将细胞混悬液用200目的滤网过滤，心室肌细胞收集于Kraft‑Brühe溶液中，室温下静置稳定0.5‑1h后备用；F、将收集于Kraft‑Brühe溶液中的心室肌细胞加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，静置后心室肌细胞沉底贴壁，用细胞外灌流液清洗细胞，流速保持1‑1.5ml/min；选择边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的心室肌细胞进行膜片钳实验，采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录L型钙通道电流；实验在22‑25℃下进行，使用的玻璃电极充满细胞内灌流液，电阻为3‑5MΩ。