[发明专利]分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法

权利要求书

1.一种分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将豚鼠猛击头部致昏迷后，开胸快速取出心脏；

B、将豚鼠心脏置于4℃的正常台氏溶液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管，置于Langendorff装置上保持温度37℃以8-10ml/min的速度进行离体心脏灌流：先以正常台氏溶液灌流5min，完全冲洗心脏内残留的血液，再用无钙台氏溶液灌流5min，至心脏完全停止搏动，再用50ml酶解液循环灌流8-10min，至心脏流出液拉丝明显，膨胀变大，颜色变淡时，再用Kraft-Brühe溶液灌流5min；

C、将心脏从Langendorff装置上取下，剪去心房和基底部组织，将心室肌组织剪成1.5-2.5mm碎块，用粗开口吸管缓慢吹打使心室肌细胞从心肌碎块上分离；

D、将分离出的心室肌细胞置于37℃水浴锅中振荡1-2min，得到细胞混悬液；

E、将细胞混悬液用200目的滤网过滤，心室肌细胞收集于Kraft-Brühe溶液中，室温下静置稳定0.5-1h后备用；

F、将收集于Kraft-Brühe溶液中的心室肌细胞加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，静置后心室肌细胞沉底贴壁，用细胞外灌流液清洗细胞，流速保持1-1.5ml/min；选择边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的心室肌细胞进行膜片钳实验，采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录L型钙通道电流；实验在22-25℃下进行，使用的玻璃电极充满细胞内灌流液，电阻为3-5MΩ。

2.根据权利要求1所述的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于：步骤B中所述的正常台氏溶液由NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM，MgCl₂的浓度为1mM，CaCl₂的浓度为1.8_mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为10mM；溶液的渗透压为290mOsm；

所述的无钙台氏溶液由NaCl、KCl、MgCl₂、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM，MgCl₂的浓度为1mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为10mM；溶液的渗透压为290mOsm；

所述的Kraft-Brühe溶液由氨基乙磺酸、乙二酸、谷氨酸、KCl、KH₂PO₄、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用KOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，氨基乙磺酸的浓度为10mM，乙二酸的浓度为10mM，谷氨酸的浓度为70mM，KCl的浓度为25mM，KH₂PO₄的浓度为10mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为0.5mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为11mM；溶液的渗透压为290mOsm。

3.根据权利要求1所述的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于：步骤F中所述的细胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl₂、CaCl₂、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，CsCl的浓度为5.4mM，MgCl2的浓度为1mM，CaCl₂的浓度为1.8mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为10mM；溶液的渗透压为290mOsm；

所述的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl₂、镁-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至7.2，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaCl₂的浓度为1mM，镁-三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为11mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为10mM；溶液的渗透压为310mOSm。