[发明专利]一种快速高效提取饮用水中总DNA的方法

摘要

本发明公开了一种快速高效提取饮用水中总DNA的方法，属于饮用水中总DNA抽提与纯化技术领域。针对饮用水中微生物量极低、传统的过滤浓缩方式难以提取到有效浓度的总DNA、复杂环境介质影响抽提的DNA纯度等问题。其步骤为：通过净水装置过滤饮用水中微生物；采用超声将微生物从滤料上洗脱；用滤膜过滤洗脱液；直接用物理研磨和化学裂解相结合的方法抽提滤膜上微生物的总DNA。最后用无水乙醇洗涤，晾干后溶于超纯水或缓冲液中。本方法经济、方便、稳定，抽提获得的DNA浓度和纯度较高，为环境分子生物学技术的应用提供了新方法。

主权项

一种快速高效提取饮用水中总DNA的方法，其步骤为第一步：采样及样品前处理在灭菌的水龙头上安装净水器，打开水龙头，让水质达标的饮用水从净水器的滤芯出水口出水，开始计时滤水，直至该滤芯被彻底堵住后方取下；过滤完成后及时将净水器关闭取下，卸下滤芯，取出里面多层的中空丝膜，放置到灭菌的烧杯中，加入超纯水，轻轻震荡让中空丝膜均匀散落在烧瓶中；然后将烧杯放置于超声波清洗机中超声振荡，超声后将水在0.98兆帕大气压下过0.45微米醋酸纤维酯滤膜；第二步：饮用水中总DNA提取将滤膜尽量剪碎，将碎片装入到样品裂解管，进行如下处理：（1）在样品裂解管中加入978微升磷酸盐缓冲液和122微升MT缓冲液；（2）用研磨珠均质器在4800转/分钟条件下裂解90秒，彻底破碎微生物细胞；（3）将样品裂解管在14000 g转速下离心15分钟；（4）将离心后管内的上清液转移到新的2.0毫升离心管中，加入250微升蛋白沉淀溶液，充分振荡2分钟；（5）14000g下再次离心5分钟去除沉淀，将上清液全部转移到干净的15毫升离心管中；（6）将一种能结合DNA溶液振荡摇匀后，加1毫升该溶液到15毫升离心管中；（7）用涡旋振荡器振荡离心管2分钟后将离心管放在支架上静止3分钟，让溶液中的二氧化硅颗粒沉淀；（8）去除500微升上清液；（9）将离心管中剩下的混合物重新混匀，取600微升溶液到离心过滤柱上，14000g离心1分钟后，去除收集管中的液体；重复上述过程，继续将剩下的混合物加入到过滤柱上离心；（10）加500微升的SEWS‑M溶液到离心柱中，用移液枪轻轻吹打溶液，将里面混合物彻底混匀；（11）14000g离心1分钟，丢弃收集管中液体；（12）不加入任何试剂，14000g离心2分钟，去除离心柱中残留的乙醇，丢弃原收集管，换上一个新的干净的1.5毫升离心管；（13）将离心柱在室温下空气干燥5分钟；（14）先加入50微升55度预热的无菌水到离心柱中，用移液枪轻轻搅动，若溶解不完全，则在加入10微升无菌水搅动，直至离心柱中二氧化硅全部成熔融状态；（15）将离心柱放置55度烘箱中加热5分钟；（16）14000g离心1分钟后，离心管中收集到得液体即提取所得饮用水中总DNA，零下20度保存。