[发明专利]一种草莓原生质体的提取及融合方法

摘要

本发明是以草莓的叶片为研究材料，提供一种草莓原生质体分离及融合的最佳方法，通过前处理和酶解相结合的方式获得高活力的原生质体，利用30-45％PEG 6000结合高Ca2+，高pH的方法诱导两者融合，提高了原生质体一对一相融合的概率，本方法作用温和，分离的原生质体活力在85％以上，一对一融合率最高可达到11.7％，操作简便，具备了形成杂种细胞的可能，适合于克服远源杂交障碍进行新品种的诱导及培育，在生物育种方面具有一定的意义。

主权项

一种草莓原生质体的提取及融合方法，其特征在于步骤如下：(1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入MS培养基培养10天，或者暗培养一周；MS培养基为6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)1.0‑1.5mg/L，蔗糖1‑1.5％和琼脂0.7％；(2)取步骤(1)预处理的叶片剪成细条并去除叶脉；(3)将材料与酶液按照1∶10体积比混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在26℃恒温、速度60r/min条件下进行暗酶解，时间11‑14h，并定时镜下观察酶解情况；酶液组成为1.0‑2.0％纤维素酶Cellulase OnozukaR‑10+0.5‑1.0％果胶酶Pectolyase Y‑23+0.6mol/L的甘露醇+0.1‑0.2％2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸MES+0.05mol/L的CaCl2的组合；(4)分别将酶解完全的绿叶东方草莓和卢比草莓的叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，离心、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2mol/L的CaCl2中，用移液器向离心管底部缓缓注入质量浓度为20％蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用6ml 0.2mol/L的CaCl2悬浮；(5)原生质体的活力测定：采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数；(6)将两种草莓的原生质体以1∶1体积比混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，静置10min，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；(7)吸取PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混匀，静止10min，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率，向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程。