[发明专利]一种草莓原生质体的提取及融合方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物品种改良技术领域，即一种草莓原生质体的提取及融合方法。

背景技术

草莓属蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)植物，多年生草本果树，它的经济价值和营养价值很高，栽种范围广。20世纪80年代以来草莓生产就有了迅速的发展，我国草莓生产上的多数品种引自国外，品种混杂，且普遍存在抗性差及品质下降等问题，真正适合我国不同气候条件栽培的品种不多，这就迫切需要选育适宜我国栽培的优良品种。

目前，国内外草莓育种主要集中在草莓的茎尖培养、花药培养、体细胞突变体筛选、草莓基因工程、草莓的细胞悬浮培养、草莓的原生质体培养及细胞融合等，应用现代生物技术是草莓品种改良的重要手段。我国在草莓现代生物技术育种研究的某些方面(如单倍体植株的获得，转化植株的再生等)处于国际先进水平，而不少方面与国外同行相比存在较大差距，抗性体细胞突变体筛选、原生质体培养以及草莓的基因转化研究尚属空白。随着草莓组织培养技术的进一步完善和生物技术的发展，解决气候、冻害、虫害的问题将更有希望。

原生质体操作是现代生物技术领域中的重要组成部分，为草莓育种工作开辟了一条新的途径。通过原生质体融合可以产生种、属间的杂种，从而克服远缘杂交障碍，另外，原生质体还可以用来分离和纯化突变体。草莓遗传上的高度杂合性、染色体多倍性和丰富的野生草莓资源，使得原生质体操作成为草莓育种的一种重要手段。

发明内容

本发明的目的在于建立高效的草莓原生质体分离、融合技术体系，以提高原生质体活力，融合效率，为草莓新品种培育提供技术支撑的草莓原生质体的提取及融合方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种草莓原生质体的提取及融合方法，其特征在于步骤如下：

(1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的MS培养基培养10天，或者暗培养一周；所述的MS培养基含有6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0-1.5mg/L，蔗糖1-1.5％和琼脂0.7％；

(2)取步骤(1)预处理的叶片剪成细条并去除叶脉；所述细条为2.0mm×2.0mm。

(3)将材料与酶液按照1∶10体积比混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在26℃恒温、速度60r/min条件下进行暗酶解，时间11-14h，并定时镜下观察酶解情况；所述的酶液组成为1.0-2.0％纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+0.5-1.0％果胶酶Pectolyase Y-23+0.6mol/L的甘露醇+0.1-0.2％2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES+0.05mol/L的CaCl₂的组合。

(4)分别将酶解完全的绿叶东方草莓和卢比草莓的叶肉原生质体悬浮液分别经200目尼龙纱网过滤后，离心、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml0.2mol/L的CaCl₂中，用移液器向离心管底部缓缓注入质量浓度为20％蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用6ml 0.2mol/L的CaCl₂悬浮(去除杂质，纯化)；

所述定时镜下观察酶解情况为酶液消化7小时后，每隔一小时在倒置显微镜下观察。

所述取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体，是用移液器吸出管底的沉淀和蔗糖溶液及上部的CaCl₂溶液。

(5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数；原生质体浓度为0.5×10⁵个/mL，六孔板滴加时每滴为0.1mL。

(6)将两种草莓的原生质体以1∶1体积比混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，静置10min，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；

(7)吸取PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混匀，静止10min，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率，向其中依次间隔5min加入高Ca²⁺，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；

所述PEG溶液组成为30-45％PEG 6000+0.3mM葡萄糖+8mM Cacl₂+0.7mMKH₂PO₄，KOH调pH为5.8。

所述高Ca²⁺，高pH洗液为50mM CaCl₂·2H₂O+0.2M甘氨酸，NaOH调pH为9-10。