[发明专利]一种检测肿瘤纳米探针的制备方法

摘要

本发明公开了一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，其步骤：（1）、构建表达铁蛋白重链的表达质粒，大肠杆菌表达、纯化铁蛋白，电子显微镜验证表征其笼型结构。（2）、在铁蛋白氨基端融合一个绿色荧光蛋白，表达纯化制备表面展示了荧光蛋白的铁蛋白笼型结构。（3）、在氨基端融合有绿色荧光蛋白铁蛋白H链的氨基端再融合一段肿瘤靶向短肽RGD，制备出表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构。（4）、基于表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构、在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，制备成具有肿瘤靶向、荧光、磁性的铁蛋白多功能探针。该纳米探针把肿瘤靶向、荧光成像、磁共振成像多功能融为一体，能够实现多模式的同步检测。

主权项

一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，其步骤是：A、通过聚合酶链式反应扩增合成人铁蛋白重链基因rHF，插入到表达载体pET‑28a上，构建出表达铁蛋白重链的表达质粒pET‑rHF，转化入大肠杆菌E. coli BL21 (λDE3)，37 ℃恒温、200 r/min 振荡培养培养至OD600 在0.4 ~ 0.6 之间，向培养物加IPTG 至终浓度1 mmol/L，培养物均在25 ℃继续诱导培养8 h 后，4 ℃、6000 g 离心收集细胞，细胞沉淀以Tris‑HCl 缓冲液：20 mM Tris‑HCl，50 mM NaCl，pH 8.0，清洗菌体一次，然后重悬于30 mLTris‑HCl 缓冲液中，超声破碎后，以12000 r/min离心30 min，收集上清液置于60 ℃水浴中反应10 min，然后12000 r/min 离心20 min，收集上清液用Amicon Ultra15 超滤管浓缩，浓缩的蛋白样品用分子筛柱Superdex 200 10/300 GL 或Superose 6 10/300 GL 纯化，收集洗脱峰,获得纯化的笼型结构的铁蛋；B、质粒pET‑rHF中插入绿色荧光蛋白基因，构建表达铁蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达质粒pET‑GFP‑rHF，大肠杆菌E. coli BL21 (λDE3)表达、纯化融合蛋白，制备出表面展示了荧光蛋白的铁蛋白笼型结构；C、在质粒pET‑GFP‑rHF中插入RGD短肽表达基因，构建表达铁蛋白‑绿色荧光蛋白‑肿瘤靶向肽RGD的融合蛋白的表达质粒pET28a‑RGF，大肠杆菌E. coli BL21 (λDE3)表达、纯化融合蛋白，制备出表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构；D、基于表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构，在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，方法为：30 mL 0.4 μM rHF 蛋白或GFP‑rHF 蛋白或RGF 蛋白的NaCl溶液脱气后加到滴定仪的反应杯中，通入高纯氮气，置于65 ℃恒温水浴中，采用滴定仪恒滴定模式，整个反应过程反应液的pH 值用50 mM 的NaOH 滴定控制在8.5，12.5 mM 的硫酸亚铁铵和4.17 mM 的H2O2新鲜配制溶液同时以0.16 mL/min 的速度加入到上述反应液中，30 分钟后停止滴加，使反应液中每个蛋白笼形结构的理论铁原子载量达到5000，反应液在停止滴加后继续反应5分钟，然后加入0.6 mL 0.3 M 的柠檬酸钠溶液螯合掉多余的铁离子，接着降温到室温，成功获得内腔合成Fe3O4纳米颗粒的铁蛋白探针，铁蛋白笼型结构表面展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽，再加上内腔的Fe3O4纳米颗粒，为完整的肿瘤靶向、荧光、磁性的铁蛋白多功能探针。