[发明专利]一种检测肿瘤纳米探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤检测技术领域，更具体涉及一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，通过在铁蛋白笼型结构表面展示荧光蛋白和RGD肿瘤靶向短肽，并在其内腔合成Fe₃O₄纳米颗粒，制备出具有肿瘤靶向、磁性、荧光三种功能的纳米颗粒探针。这种三功能纳米探针能够用于肿瘤细胞或活体的肿瘤靶向的磁共振成像(MRI)和荧光成像等检测。 

背景技术

癌症是人类死亡主要原因之一。尽管肿瘤生物学和肿瘤医学有了很大的发展，比如：肿瘤生物标记物的发现，简便的手术流程，放疗和化疗的发展，但是总癌症存活率在过去的二十年中都没有显著的提高。为了提高肿瘤患者的存活率，我们急需发展新的肿瘤早期诊断方法和治疗方法。 

纳米科学和技术的发展带动了用于分子细胞成像和癌症治疗的纳米材料的发展，也带动了用于癌症检测和筛查的纳米器件的开发。纳米颗粒不仅能提供癌症病人的高灵敏和特异性成像信息，而且还能运输抗癌药物到肿瘤的位置。当前，我们在以下这三个方面的认识还是有限的：一是适合用来成像的生物标记物；二是成像靶标和反差增强材料的选择；三是用来使成像探针生物化的化学方法。我们在发展癌症特异性成像试剂上同样遇到很多困难，比如：1)靶向组织或肿瘤的探针的运输；2)生物相容性和生物毒性；3)探针的稳定性和体内信号增强的有效性；4)足够多的成像方法和策略。 

当今，肿瘤靶向性的纳米探针的发展也存在很大的挑战。磁共振成像(Magneticresonance imaging，MRI)是一种很好的成像方式，提供了细腻的软组织对比度，能够揭示组织形态学和解剖学上的细节，甚至可以用于动物和人的全身成像。磁性造影剂常被用来增强反差和放大信号。虽然钆-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)有很强的缩短T1值的效应而且在临床上被广泛接受，但是它反差效应相对较低且体内存留时间过短。细胞内吞钆时和内吞钆后的毒性和生物相容性还是未知的。最近，磁性氧化铁纳米颗粒成为新一代的靶向特异性的MRI T2造影剂。磁性氧化铁纳米颗粒比Gd-DTPA在促进弛豫方面更有效。磁性氧化铁纳米颗粒的磁学性质可以通过控制核心的大小和表面修饰物来操控。更重要的是，磁性氧化铁纳米颗粒具有很长的血液存留时间，生物降解性和低生物毒性等特性。 

尽管我们在发展基于磁性氧化铁纳米颗粒的MRI造影剂方面做出了很多努 力，但是很多难题依然存在。主要的难题是发展一种表面修饰材料，该材料不仅可以稳定纳米颗粒还可以提供用于探针分子可控生物交联的活性功能基团。传统的用于稳定磁性氧化铁纳米颗粒的分子(如：葡聚糖)由于与纳米颗粒间的相互作用力弱，所以很容易从纳米颗粒的表面脱落下来而导致纳米颗粒在生理条件下和储存期间的团聚、沉淀。 

同时，虽然MRI是肿瘤学的一种主要成像方法，但是用于分子和细胞成像时它的分辨率很有限。而且，单独的MRI造影剂如磁性氧化铁纳米颗粒难以靶向肿瘤细胞或组织。 

铁蛋白是一个由24个结构相同的亚基自组装形成的八面体对称的球状蛋白笼形结构。铁蛋白的外部直径是12nm，内部是一个6-8nm的空腔。铁蛋白同SV40一样也是一种典型的蛋白笼形结构。内源性人类铁蛋白有两种不同的亚基组成，H链和L链，H链和L链的分子量大小不同，分别是21kDa和19kDa。H链含有一个保守的亚铁氧化酶的酶活性位点，可以催化两个Fe²⁺氧化；L链内部带有大量的负电荷，参与铁氧化物核心的形成。在哺乳动物铁蛋白的H链内有一个能催化Fe²⁺氧化成Fe³⁺的亚铁氧化酶。哺乳动物铁蛋白的H链单独也能自组装成24聚体球状蛋白笼形结构。铁蛋白的氨基端伸向外表面，非常易于基因操作，融合各种蛋白和短肽。 

所以，尝试基于铁蛋白笼型结构发展一种具有肿瘤靶向、磁性、荧光等三种功能的纳米颗粒，用于肿瘤靶向的磁共振成像和荧光成像。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，在铁蛋白H链的氨基端融合一个绿色荧光蛋白(GFP)，然后再融合一段RGD肿瘤靶向短肽。纯化好的带有肿瘤靶向肽和GFP的铁蛋白，再在其内腔合成Fe₃O₄纳米颗粒，从而发展具有肿瘤靶向、磁性、荧光等三种功能的纳米颗粒探针一种的三功能纳米颗粒。这种三功能纳米探针能够用于肿瘤的活细胞或活体的肿瘤靶向的磁共振成像(MRI)和荧光成像等肿瘤的方便检测。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，其步骤是：