[发明专利]一种高效制备灵芝原生质体的方法

摘要

本发明涉及一种高效制备灵芝原生质体的方法。该方法包括如下操作步骤：它以灵芝为菌种，经PDA培养基活化、摇瓶发酵培养后，1%溶壁酶+0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶组成的复合酶液酶解灵芝菌丝体，甘露醇洗涤和稀释后获得较高产量的灵芝原生质体，调整浓度到104～106个/ml，采用紫外线诱变后，接种到再生培养基上28℃培养。本发明分离的细胞悬液原生质体得率较高，在再生培养基上生长状态好，可满足后续细胞生物学方面的研究。

主权项

一种高效制备灵芝原生质体的方法，其特征是：依序包括如下步骤：   （1）菌丝体制备将菌种接种到PDA斜面上，等菌丝体刚好覆盖满PDA斜面，停止培养；挑取斜面上的菌种接种到摇瓶发酵培养基，28℃150r/min摇瓶发酵96～120h；培养好的菌丝分装到50ml无菌离心管中，4℃4000r/min离心10min；用10倍的0.6M甘露醇清洗5～6次，去除残留培养基；   （2）菌丝体酶解复合酶液：1%溶壁酶+0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶；酶液用0.6M甘露醇配制后‑20℃低温保存备用；30℃300r/min强烈震荡酶解菌丝体150min；   （3）原生质体分离酶解完成后，立即分装到50ml无菌离心管中4℃4000r/min离心10min，酶液转移后再离心分离一次，合并两次离心的沉淀；沉淀用0.6M甘露醇清洗5～6次（10倍体积），每次的清洗液再分离一次；   （4）收集原生质体分离的沉淀合并后，用0.6M甘露醇重悬；1500r/min离心10min，转移上清，沉淀再用甘露醇清洗5～6次，分离上清，最后的沉淀（细胞碎片和培养基杂质）弃去；合并上清，分装到50ml离心管后500r/min离心10min，保存上清，沉淀合并后再清洗几次；最后获得的上清3000r/min离心10min即可获得原生质体；（5）原生质体的稀释剂保存最后的沉淀用甘露醇溶解并稀释；血球计数板计数，调整浓度到104～106个/ml；4℃保存，用于后续的诱变及再生；（6）诱变 采用紫外线作为诱变剂，取稀释后的原生质体涂布到再生培养基上，28℃培养120～144h。