[发明专利]一种高效制备灵芝原生质体的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种高效制备灵芝原生质体的方法。

背景技术

灵芝是一种珍贵的中药材。灵芝含有多种药用活性成分，具有抗HIV，抗肿瘤等药理活性。天然灵芝品种中，有效成分含量相对较低。通过传统的生物育种方法，培育高产量的新品种具有很大的经济价值和社会价值。灵芝新品种的获得可以通过诱变产生。通过物理和化学复合诱变培育新品种为越来越多的研究者所采用。灵芝的诱变通常有孢子体诱变和原生质体诱变两种方法。

孢子体有坚韧的外壳，需要强烈的诱变刺激（如Co⁶⁰+UV复合诱变），诱变难度大，突变几率小，诱变后不容易筛选且筛选周期长。原生质体诱变是一种间接的诱变方法，具有简便快速，筛选方便等诸多优点，克服了孢子体诱变的多种缺点。在原生质体诱变中，高质量的原生质体对诱变及筛选的成功至关重要。虽然灵芝原生质体的制备已有相关的文献报道，但这些方法制备原生质体得率较低，纯度不高。

在多次的实验摸索过程当中，我们开发出一种高效制备灵芝原生质体的实验方法。该方法具有快速，高效，经济等优点，多次试验证明可以为高质量的诱变实验提供保证。原生质体制备过程中酶的用量比较大，尤其溶壁酶的价格比较贵。该方法中，多次的重复洗涤和合理的离心转速确保了绝大多数酶解后的原生质体得以分离，节省酶且细胞悬液纯度高。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术和方法的不足，发明一种高效的制备灵芝原生质体的方法，它以灵芝为菌种，经PDA培养基活化、摇瓶发酵培养后，1%溶壁酶+0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶组成的复合酶液酶解灵芝菌丝体，甘露醇洗涤和稀释后获得较高产量的灵芝原生质体。经紫外线诱变后，可在再生培养基上稳定生长。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种高效制备灵芝原生质体的方法，依序包括如下步骤：

（1）菌丝体制备

将菌种接种到PDA斜面上，等菌丝体刚好覆盖满PDA斜面，停止培养。挑取斜面上的菌种接种到液体摇瓶发酵培养基，28℃150r/min摇瓶发酵96～120h。培养好的菌丝分装到50ml无菌离心管中，4℃4000r/min离心10min。用10倍的0.6M甘露醇清洗5～6次，去除残留培养基。

（2）菌丝体酶解

复合酶液：1%溶壁酶+0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶。酶液用0.6M甘露醇配制后-20℃低温保存备用。30℃300r/min强烈震荡酶解菌丝体150min。

（3）原生质体分离

酶解完成后，立即分装到50ml无菌离心管中4℃4000r/min离心10min，酶液转移后再离心分离一次，弃上清，合并两次离心的沉淀。沉淀用0.6M甘露醇清洗5～6次（10倍体积），每次的清洗液再离心分离一次。

（4）收集原生质体

分离的沉淀合并后，用0.6M甘露醇重悬。1500r/min离心10min，转移上清，沉淀再用甘露醇清洗5～6次，分离上清，最后的沉淀（细胞碎片和培养基杂质）弃去。合并上清，分装到50ml离心管后500r/min离心10min，保存上清，沉淀合并后再清洗几次。最后获得的上清3000r/min离心10min即可获得原生质体。

（5）原生质体的稀释剂保存

最后的沉淀用甘露醇溶解并稀释。血球计数板计数，调整浓度到10⁴～10⁶个/ml。4℃保存，用于后续的诱变及再生。保存时间最好不要超过1W时间，否则原生质体活力下降，再生率显著降低。

（6）诱变

    取稀释后的原生质体悬液涂布到再生培养基上，采用紫外线作为诱变剂，28℃培养120～144h。

本发明的优点是：（1）步骤简单，制备时间较短，显著提高了灵芝原生质体的富集效率；（2) 合理的酶制剂添加比例，多次的重复洗涤和适宜的离心转速确保了绝大多数酶解后的原生质体得以分离，制备的细胞悬液纯度高。

附图说明

图1 PAD斜面培养菌丝。

图2 发酵前后对比。

图3 显微镜下观察制备的原生质体 。

图4 原生质体平板上再生。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。

实例一：

（1）菌丝体制备