[发明专利]一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用，其步骤：A、hTRIM25基因的获取：参照人源TRIM25基因序列，设计一对引物；B、真核表达载体pCA-hTRIM25eGFP的构建：通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA-hTRIM25。然后用SalI和XhoI分别酶切pEGFP-C1和pCA-hTRIM25，回收载体pEGFP-C1和含有启动子和hTRIM25片段并用T4ligase连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定；C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株的构建：通过脂质体法Lipofectamine2000将pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG转染BHK-21细胞，转染后筛选，通过间接免疫荧光和Westernblotting鉴定hTRIM25蛋白的表达，为BHK21-hTRIM25eGFP。该株在制备治疗或预防FMDV药物中的应用。构建的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株能稳定表达hTRIM25蛋白；稳定表达hTRIM25基因的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP能够抑制口蹄疫病毒复制；hTRIM25基因用来构建转基因小鼠和转基因猪等转基因动物。

主权项

一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法，其步骤是：A、hTRIM25基因的获取：参照人源TRIM25基因序列，设计一对引物：phTRIM25F：5’‑TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC‑3’；phTRIM25R：5’‑TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG‑3’；提取Hela细胞RNA为模板，以通用引物扩增获得cDNA后，用特异引物phTRIM25F和phTRIM25R扩增hTRIM25基因，在其5‘端和3’端分别引入EcoRI和XhoI，进行亚克隆，其反应体系为：模板cDNA 5.0 μL，1 0×LA buffer 5.0μL，phTRIM25F、phTRIM25R引物各1.0μL：终浓度为10pmol/L，LA 酶 0.25μL，dNTPS 1.0μL，加ddH2O 至50.0μL，按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8%g/v的琼脂糖凝胶电泳，一条大小1893bp带为hTRIM25基因；B、真核表达载体pCA‑hTRIM25eGFP的构建：通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA‑hTRIM25，然后用SalI和XhoI分别酶切pEGFP‑C1和pCA‑hTRIM25，回收载体pEGFP‑C1和含有启动子和hTRIM25片段并用T4 ligase连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定，结果表明成功获得pCA‑hTRIM25eGFP；C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21‑hTRIM25eGFP细胞株的构建：通过脂质体法Lipofectamine 2000 将pCA‑eGFP和pCA‑hTRIM25eGFPG转染BHK‑21细胞，转染36小时后用800μg/μL G418筛选，进行5轮后，通过间接免疫荧光和Western blotting鉴定hTRIM25蛋白的表达，为BHK21‑ hTRIM25eGFP；① 间接免疫荧光鉴定hTRIM25蛋白的表达：将BHK‑eGFP和转染人源TRIM25的BHK‑TRIM25eGFP 细胞接种于24孔细胞培养板，待细胞长满单层，进行间接免疫荧光，多聚甲醛固定，一抗为抗V5单克隆抗体，二抗为抗鼠的Ig‑G‑RFP FITC，绿荧光蛋白与hTRIM25融合，细胞直接在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号，用抗V5抗体进行间接免疫荧光，红色荧光信号表明hTRIM25的表达，构建细胞株BHK21‑hTRIM25eGFP；② Western blotting鉴定外源基因hTRIM25的表达：收集长满单层BHK‑eGFP和BHK‑hTRIM25eGFP 细胞，提取蛋白，进行SDS‑PAGE和Western blotting检测，一抗为抗V5单克隆抗体，二抗是HRP标记的鼠抗兔单克隆抗体，结果在BHK21‑ hTRIM25eGFP细胞中有75KD的特异性阳性带，与hTRIM25蛋白大小相符，正常BHK‑eGFP细胞阴性，表明BHK21‑ hTRIM25eGFP细胞株中hTRIM25有效表达。