[发明专利]一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及病毒学和抗病育种领域。更具体涉及一种抑制口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth DiseaseVirus，FMDV)增殖的TRIM25基因，同时还涉及一种抑制口蹄疫病毒增殖的TRIM25基因的制备方法，还涉及一种TRIM25基因在制备治疗或预防FMDV药物中的应用。

背景技术

我国是世界养猪第一大国。养猪业是我国畜牧业的主导产业，猪肉占肉类的67.7％，是我国人民动物蛋白质的最主要来源。猪病严重制约着我国养猪业发展。近年来，口蹄疫、猪繁殖与呼吸道综合征等重大疾病频频爆发，对我国养猪业造成巨大损失。口蹄疫的暴发不但影响到经济发展、国际贸易，而且对社会的稳定构成威胁，因此又称之为“政治经济病”。联合国粮农组织(FAO)和世界动物卫生组织(OIE)都将该病列为重要动物传染病，并列入重大跨国动物疫病的全球消灭计划。在国际上，口蹄疫(Foot-and-Mouth disease，FMD造成的经济损失巨大。如2001年2月由英国引发的FMD使得法国、爱尔兰、荷兰等欧盟国家相继暴发该病，南美的阿根廷也暴发FMD。英国在此期间共宰杀动物达450万头，由此造成的全部经济损失高达90亿英磅，而且2007年英国又发生两起FMD疫情。有经济报告分析，如果畜牧业十分发达的美国暴发FMD，当年的直接和间接损失将分别是40亿美元和400亿美元。

我国的FMD疫情非常严重。据统计资料表明，1999-2003年期间，我国发病动物总数达890616头(只)，遍及31个省、市、自治区，疫情暴发次数1129个，疫点数2375个。2003年4月份以后，O型FMD出现了我国罕见的基因型毒株，泛亚毒株又卷土重来。青海和新疆分别发现了A型和Asia I型FMD。新疆O型和Asia I型FMD同时流行，在病畜中还发现O型和Asia I型混合感染。2009-2010年猪O型FMD耿马毒在我国养猪场大面积的流行。而且各亚型之间无明显的交叉保护，增加了疫情的复杂性和控制难度，使防疫工作面临很大困难。因此如果能培育出抗FMD的猪新品种，将能从根本上解决FMD防控问题，而其关键是发掘抗FMDV复制的抗性基因。目前研究表明，FMDV对干扰素非常敏感，干扰素处理的细胞能够很好的抑制FMDV的增殖，因而激活干扰素信号通路的宿主信号分子具有抗FMDV复制的潜力。

三基序(Tripartite motif，TRIM)蛋白家族包括60多个成员，在生物学过程中发挥多种功能，如细胞分化、发育、发展、凋亡和免疫等(Quaderi et al.，1997；Avela et al.，2000)。TRIM蛋白具有共同的特征性的三基序，三个锌指结合区，一个RING指以及1～2个B-Box和一个环状的环区，因而称为RBCC(Boxden，1998)。C末端在不同的分子间存在差异，大多有一个或更多的特异区域来决定该TRIM蛋白特异功能。TRIM RING区域具有E3泛素化连接酶活性，介导不同底物的翻译后修饰。通过CC区自我关联，TRIM蛋白寡聚体化并充当支架组装成多蛋白复合物占特异的细胞层。最新研究表明，TRIM超家族中的多个成员由干扰素诱导表达，并且在参与了多种与天然免疫相关的生物过程。TRIM25RING E3泛素连接酶能使病毒RNA受体维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1)的N段泛素化，进而与下游MAVS结合激活宿主干扰素信号通路，启动IFN-β的产生，发挥抗病毒作用(McNab et al.，2011；Gack et al.，2007；Gack et al.，2008；Yoneyama and Fujita，2001)。

动物病毒性疫病的预防传统上主要通过疫苗的免疫预防接种，在动物疫病预防与控制中发挥着极其重要的作用。由于FMDV各亚型之间无明显的交叉保护，增加了疫情的复杂性和控制难度，使防疫工作面临很大困难。近年来随着转基因等生物技术的快速发展，动物的分子抗病育种得到长足的进步，可以从源头上控制疫病尤其是病毒性疾病的发生。分子抗病育种是控制疾病有效的策略之一，如将疫苗免疫和分子抗病育种结合在一起必将有助于动物疫病的控制。以人源FMDV(hFMDV)蛋白为研究对象，利用过表达hTRIM25蛋白的细胞株来评价hTRIM25对FMDV增值的影响，为FMDV的抗病毒育种提供优良的候选基因奠定基础。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种稳定表达人源TRIM25基因(hTRIM25)的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP。该细胞可以稳定表达hTRIM25和绿荧光蛋白eGFP，用于体外研究TRIM25蛋白抗病毒活性的优良材料。