[发明专利]一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法及应用，步骤是：A、根据PPR基因保守氨基酸位点设计兼并引物；B、用CTAB法抽取油菜细胞质雄性不育恢复系的叶片DNA，采用降落PCR扩增出特异的恢复基因候选片断；C、PCR产物回收、转化、测序及序列分析；D、进行5’RACE与3’RACE，将测序结果拼接，获得全长cDNA序列；E、根据拼接好的全长cDNA序列在其5’UTR与3’UTR区设计特异引物，获得分子标记。同时公开了一种恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用方法，提高了恢复系选育的速度与鉴定效率，方法易行，操作性强，鉴定恢复材料速度快，极大减轻了恢复性鉴定必需经过测交及后代种植观察的工作量，提高了杂交种选育的效率。

主权项

一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法，其步骤是：A、选取拟南芥1号染色体臂PPR基因AT1G126209, AT1G63070, 萝卜细胞质雄性不育的恢复基因Rf0，从美国国家生物技术信息中心数据库中提取各基因的蛋白质序列，进行多序列比对，在保守氨基酸位点处兼顾简并度最小原则设计间并引物，正向引物序列为TTY GTN AAG GAR GGN AAG CT，反向引物序列为DAT RAG NGT RTT RTA NGT AAC；B、用CTAB法抽取油菜异源细胞质雄性不育恢复系的叶片DNA，采用降落PCR程序进行扩增，PCR扩增体系为：TaqMIX 10µl，DNA模板1µl,正反向引物各2.5µl,ddH2O 4µl，降落 PCR程序为：95℃ 2 min,14个循环，然后95℃ 30 s, 40℃ 45 s,72℃ 2 min,25个循环，PCR扩增产物用2% g/v琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测；C、PCR产物回收、转化及测序：使用E.Z.N.A GEL extraction kit试剂盒回收目标片断，用PGEM‑T vecter试剂盒连接后于16℃过夜，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性克隆，挑选3‑5个阳性克隆繁殖后，菌液送样测序；D、特异片段DNA序列分析：将从恢复系DNA中扩增得到的特异片段测序，获得长度为309 bp的序列，将特异片段的DNA序列送至NCBI基因序列库进行BLAST检索，获得了三个高度同源的基因序列，其中一个是从具有油菜波里马CMS育性恢复性状的一个白菜型油菜材料中得到的克隆，在该区段上的一致性达85%，是一个1953bp的表达基因序列，编码含有16个PPR基序的蛋白，与拟南芥1号染色体臂上的PPR基因AT1G12300的同源性在70%以上；E、特异片段可能编码的氨基酸序列及蛋白基序分析：使用EBI transeq将此长度为309 bp的片段翻译成蛋白质序列，结果表明该片段编码103个氨基酸残基，将这103个氨基酸序列提交至Smart进行结构域预测，发现其含有两个PPR蛋白基序，各基序为35个氨基酸，属于PPR基因家族的p亚族，其中第一个PPR基序位于27‑61个氨基酸区域，接着第二个位于62‑96个氨基酸区域，两个PPR基序的预测值分别为4.00e‑10和6.60e‑12，将这103个氨基酸序列提交NCBI进行BLAST同源性搜索，获得的同源序列除了拟南芥的PPR基因之外，全部是与植物CMS恢复基因相关的序列，包括萝卜及甘蓝型油菜萝卜质CMS、甘蓝型油菜波里马CMS、水稻CMS和矮牵牛CMS的恢复基因；F、含特异片段的全长cDNA的获得：根据所得的DNA片段设计引物，使用SMART RACE CDNA AMPICATION KIT,分别进行5’RACE与3’RACE，设计的RACE引物序列如下：3’RACE GSP：5’GGCTAAGCAGATGATGGACCTGATGGCTAGCAAGGG3’, 5’RACE GSP: 5’ATGTCCACGAGAGGGGTGGTTGCCAATACA3’；将扩增得到的RACE片段分别回收测序，测序结果经SEQMAN软件拼接，获得全长cDNA序列；G、根据拼接好的全长cDNA序列在其5’UTR与3’UTR区设计引物，使用该基因特异引物分别对育性分离群体中可育株与不育株进行RT_PCR扩增，并对异源细胞质雄性不育系统的恢复系、保持系、不育系以及同源细胞质雄性不育系统的恢复系基因组DNA进行扩增，PCR扩增体系及程序为：TaqMIX 10µL，DNA模板1µL,正反向引物各1.5µL ,ddH2O 6µL，PCR扩增程序为95℃ 5min,94℃ 30 s,64℃ 45s,72℃ 3 min,共34个循环，然后75℃ 10min，PCR扩增产物用1.5%g/v琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测，在异源细胞质雄性不育恢复系中有分子量约2.1kb的扩增产物，在不育系、保持系及同源细胞质雄性不育恢复系中都无扩增产物，因此，根据全长cDNA序列5’UTR与3’UTR区设计的特异引物，其正向引物的序列为：TACGCGGGGAGAGAAGCTTGTCTCG，反向引物的序列为： CACATCATAACACACTAACCAGGACTTTGTCTC，扩增出的长度约为2.1kb 的DNA片段作为油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，获得了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记。