[发明专利]一种组织工程人角膜上皮的重建方法

摘要

本发明涉及一种组织工程人角膜上皮的重建方法，是利用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液将人角膜上皮细胞体外培养至对数生长期，采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA消化法获得完全去除上皮层的消化羊膜载体支架，平铺在插入式培养皿中牢固干贴后，将悬浮于含有IV型胶原蛋白和10％小牛血清的DMEM/F12培养液的对数生长期人角膜上皮细胞，接种至平铺有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中采用气-液界面培养法进行组织工程人角膜上皮的体外重建。本发明工艺科学合理，所重建的组织工程人角膜上皮可用于批量生产，满足广大角膜上皮病盲患者临床角膜移植治疗对组织工程人角膜上皮的大量需求，且组织工程人角膜上皮体外重建和临床治疗的成本低。

主权项

一种组织工程人角膜上皮的重建方法，包括1)人角膜上皮种子细胞悬液的制备、2)羊膜载体支架的制备和3)组织工程人角膜上皮的培养步骤，其特征在于，上述步骤1)是用人角膜上皮细胞系的细胞来制备人角膜上皮种子细胞悬液，其中人角膜上皮细胞系的构建方法是：将角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再将角膜进行消化处理后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜上皮组织块后，将角膜上皮组织块向下贴于培养孔的底部，使前弹力层向上；然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间换培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，传代至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；所述的培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液。