[发明专利]一种组织工程人角膜上皮的重建方法

权利要求书

1.一种组织工程人角膜上皮的重建方法，包括1)人角膜上皮种子细胞悬液的制备、2)羊膜载体支架的制备和3)组织工程人角膜上皮的培养步骤，其特征在于，上述步骤1)是用人角膜上皮细胞系的细胞来制备人角膜上皮种子细胞悬液，其中人角膜上皮细胞系的构建方法是：将角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再将角膜进行消化处理后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜上皮组织块后，将角膜上皮组织块向下贴于培养孔的底部，使前弹力层向上；然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间换培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，传代至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；所述的培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液。

2.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的含抗生素的消毒液为用0.9％生理盐水配制的质量比浓度为20％～70％的庆大霉素溶液。

3.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的角膜进行消化处理是用浓度为0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液消化，消化时间为1～2min。

4.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步骤1)制备人角膜上皮种子细胞悬液是取人角膜上皮细胞，用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃扩增培养至对数生长期，经0.25％胰蛋白酶溶液消化和1000～1500转/分钟离心10～15分钟获得人角膜上皮细胞沉淀，再用含有10％小牛血清和0.005％～0.01％IV型胶原蛋白的DMEM/F12培养液将该细胞沉淀悬浮成人角膜上皮细胞悬液，其中细胞浓度为8×10⁶～3×10⁷个/mL。

5.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步骤2)羊膜载体支架的制备是用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA溶液等体积混合对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化，以彻底去除羊膜上皮细胞，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成与6孔培养板插入式培养皿孔径相同的去上皮层消化羊膜圆片，使其上皮面朝上平铺于6孔培养板插入式培养皿的底部，放置于5％CO₂培养箱中在37℃条件下牢固干贴后制成载体支架。

6.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步骤3)组织工程人角膜上皮的培养是将在贴有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入上述准备好的人角膜上皮细胞悬液0.1～0.2毫升，使细胞悬液均匀分散于插入式培养皿中，6孔培养板孔中不加培养液，置5％的CO₂培养箱中37℃培养20～24小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0.8毫升含10％小牛血清的DMEM培养液的6孔培养板中，建立气-液界面培养环境，在5％CO₂培养箱中37℃培养启动组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔24～36小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6～8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。