[发明专利]用人间充质干细胞为滋养层培养诱导多能干细胞的方法

摘要

本发明提供一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导多能干细胞的方法，用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三~第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞，从儿童包皮成纤维细胞获得人iPSCs，经扩增培养，接种到滋养层细胞，诱导多能干细胞。本发明使用人骨髓间充质干细胞代替传统方法中用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增，且长期维持了人iPSCs的生物学特性和多潜能性，为人诱导多能干细胞进入临床应用提供了可能。

主权项

一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导性多能干细胞的方法，通过以下技术方案实现：（1）滋养层细胞的准备：用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三~第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞，细胞接种到用0.1%gelatin处理后的六孔板上，细胞融合度80%‑90%，并用10ug/ml的丝裂霉素C处理2小时灭活，灭活后的细胞24小时内使用；（2）人诱导性多能干细胞的获得：取2‑3岁儿童包皮成纤维细胞，用携带有Klf4、Sox2、Oct4和c‑Myc转录因子的逆转录病毒转染两次，第二天在培养体系中加维生素C 25ug/ml，第五天加入VPA2 μM，第六天将转染后的成纤维细胞接种到滋养层细胞上，第七天，换用含bFGF、替代血清的人ESCs培养液，随后每天换液，直到出现类ESCs的克隆，挑选、扩增培养；（3）人诱导性多能干细胞的扩增培养：显微镜下挑选类ESCs的克隆，用IV型胶原酶消化5‑10分钟后，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上，每天换液，每7‑8天传代一次，扩增后的细胞用机械法传代；（4）人诱导性多能干细胞的生物学特性和多潜能性的维持：在以人骨髓间充质干细胞为滋养层上扩增培养14代以后，用RT‑PCR法鉴定扩增培养后人诱导性多能干细胞的ESCs特异基因表达情况，同时用EB形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否可向三胚层分化。