[发明专利]用人间充质干细胞为滋养层培养诱导多能干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种以人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养诱导多能干细胞的方法。

背景技术

诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）是近年来干细胞研究领域中具有里程碑意义的突破。其是通过异位表达几个与维持胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）多潜能性相关的关键性核转录因子，使体细胞发生重编程，得到的一种类似ESCs的多潜能细胞，可以在体内外分化为三胚层的所有组织细胞。由体细胞重编程而来的iPSCs为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径，且不再使用人类早期胚胎和卵母细胞，故伦理学的争论将随之平息，核移植技术缺乏卵母细胞和技术繁杂的窘境也得到了合理的解决。是组织工程和再生医学、疾病模型、药物筛选的理想种子细胞，因此具有广阔的临床应用背景。目前，研究者已在体外将人iPSCs向各种组织细胞诱导分化，如造血干/祖细胞、红细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、胰岛β细胞、肝脏细胞等；建立了多种遗传性疾病人iPSCs疾病模型，用于发病机制的研究，并在动物模型上尝试通过对有遗传缺陷的iPSCs进行基因改造，治疗遗传性疾病；建立多种肿瘤iPSCs疾病模型，用于发病机制的研究和药物筛选。

人iPSCs的体外培养需要细胞与细胞的相互作用、各种细胞因子、基质等来维持其自我更新和多潜能性。其经典培养模式是以小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic fibroblasts，MEF）为滋养层，用含bFGF、血清替代物（serum replacement，SR）的培养液培养。但是，人iPSCs进入临床应用前，去除培养体系中异源蛋白、细胞污染是必须解决的一个问题。因此，自人iPSCs出现以后，研究者就开始尝试改善其培养体系，在维持其自我更新和多潜能性的同时，减少异源蛋白、细胞的污染。如2010年，Christian等用永生化的人皮肤成纤维细胞作为滋养层，培养人iPSCs，发现这种人源化的滋养层可产生和维持人iPSCs的培养，但其培养时间较短（报道的培养代数为7代）；同年，Kristiina等用一种成分明确的无异源蛋白的RegES培养液培养人iPSCs，发现其能长期（＞80代）维持iPSCs的自我更新和多潜能性，但是并没有证明在重编程过程中，该培养液可使人体细胞重编程为iPSCs。Ruth等用另一种成分明确的mTeSRTM培养液悬浮培养人iPSCs，发现培养17代后，仍可维持其自我更新和多潜能性，但是该培养体系价格昂贵，且同样没有证明在重编程过程中，该培养液可使人体细胞重编程为iPSCs。因此，进一步开发研究人iPSCs人源化的培养体系，包括重编程过程和维持培养，以及对iPSCs生物学特性的影响，是人iPSCs走向临床应用的重要前提。

发明内容

本发明的目的是提供一种用人骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）作为滋养层培养人诱导多能干细胞（iPSCs）的方法，通过以下技术方案实现：

（1）滋养层细胞的准备：用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三~第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞。人骨髓间充质干细胞采用目前常用的Ficoll-paque密度梯度离心结合贴壁筛选分离培养获得。作为滋养层时，细胞接种到用0.1%gelatin处理后的六孔板上，细胞融合度达80%-90%（约2×10⁴/cm²），并用10ug/ml的丝裂霉素C处理2小时灭活，灭活后的细胞24小时内使用；

（2）人iPSCs的获得：取2-3岁儿童包皮成纤维细胞，用携带有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc转录因子的逆转录病毒转染两次。第二天在培养体系中加维生素C 25ug/ml，第五天加入VPA2 μM（共使用5天），第六天将转染后的成纤维细胞接种到滋养层细胞上，第七天，换用含bFGF、替代血清的人ESCs培养液。随后每天换液，直到出现类ESCs的克隆，挑选、扩增培养；

（3）人iPSCs的扩增培养：显微镜下挑选类ESCs的克隆，用IV型胶原酶消化5-10分钟后，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上。每天换液。每7-8天传代一次。扩增后的细胞用机械法传代，即用5ml的玻璃滴管将细胞从滋养层上轻轻刮下，随后轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上；