[发明专利]一种鉴别结核分枝杆菌的多重PCR试剂盒

摘要

本发明属于生物医学检测领域，与微生物分子生物学检测技术领域有关，本发明具体涉及一种能够对结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌以及卡介苗同时进行快速鉴别诊断的多重PCR试剂盒。公开了针对上述分枝杆菌4个差异基因16S rRNA、IS6110、Rv2652、Rv3873特异性片段设计的4个引物对序列及多重PCR的扩增条件。本发明能够从结核病人的痰液样本中快速准确地扩增出结核分支杆菌复合群序列，并能进行种类鉴定。灵敏度为50个CFU/模板，远高于抗酸染色法，并大大简化了结核分枝杆菌的查验程序，加快了检测速度，同时还可经一次PCR鉴定多种分枝杆菌菌种，为结核病的临床快速诊断和分子流行病学调查提供了技术手段。

主权项

一种同时鉴别结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗的多重PCR试剂盒，其特征在于，它包含下列试剂组合物：(1)扩增16S rRNA基因片段的引物对：引物1：5’ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3’，引物2：5’CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3’；(2)扩增IS6110基因片段的引物对：引物3：5’CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3’，引物4：5’TACTACGACCACATCAACCGGGAG3’；(3)扩增Rv2652基因片段的引物对：引物5：5’CGAGCACCAAAACGTCCCTC3’，引物6：5’GACCCGAAACCCGGAAAGAG3’；(4)扩增Rv3873基因片段的引物对：引物7：5’TCGCGTTGACCGAGATGGATTAT3’，引物8：5’CGCTCATCTCACCCAGTTGGC3’；(5)10×酶切缓冲液；(6)Taq酶；(7)d NTP；(8)甜菜碱；和(9)小牛血清白蛋白；在一个反应总体积为20μL的PCR反应体系中的用量：引物1(10μM)：            1.5μL；引物2(10μM)：            1.5μL；引物3(10μM)：            0.5μL；引物4(10μM)：            0.5μL；引物5(10μM)：            1.0μL；引物6(10μM)：            1.0μL；引物7(10μM)：            0.7μL；引物8(10μM)：            0.7μL；10×酶切缓冲液            2μL；Taq酶(5U/μL)             0.6μL；d NTP(10mM)               1μL；甜菜碱(0.5M)                4.5μL；小牛血清白蛋白(10mM)        2μL；模板DNA                     2μL；PCR反应扩增程序：预变性：℃95℃5分钟；变性：95℃45秒；复性：56℃50秒；延伸：72℃2分钟；循环次数：30次；延伸：72℃10分钟。