[发明专利]一种鉴别结核分枝杆菌的多重PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种微生物分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于快速鉴别诊断结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌以及卡介苗的多重PCR检测试剂盒。

技术背景

20世纪90年代以来，以聚合链式反应(PCR)为代表的分子生物学诊断技术在医学领域得到了的飞速发展。直到1989年研究者首次将这一技术引入到结核病的诊断以来，立即成为结核病诊断领域中备受关注的焦点。经过多年的科学研究和临床检验，使这一技术日趋完善，其反应灵敏、快速、特异的特点在多数报告中得到验证。

近年来，结核病的流行出现了新情况，也对结核病的诊断工作提出了新要求。非结核分枝杆菌和牛分枝杆菌感染呈上升趋势，感染结核病的诊断和治疗，日益引起人们的关注。由于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非结核分枝杆菌的致病性和药物敏感性不尽相同，在临床治疗前进行病原菌的鉴别诊断显得尤为重要。目前普遍采用的方法是依靠生化手段进行型别鉴定，该方法存在耗时长、操作复杂、主观性强等缺点。而以基因分型鉴定为基础的单重PCR需要多次反应才能完成分型鉴定全过程，不仅耗时耗力，同时也增加了不确定性。

结核分枝杆菌复合群多重PCR技术是在同一PCR反应体系中，设计多对特异性引物，针对不同特异性靶区域进行扩增，经凝胶电泳检测观察各特异性扩增片段，用于结核分支杆菌检测和菌种鉴定。国内外的很多学者也做了很多相关工作，并取得一定成绩。国内2000年Ikon.JA，张宏图等首先建立了一种多重PCR方法能够特异性检测出结核分枝杆菌复合群，鸟型结核复合体以及蔓生长分枝杆菌(Ikon.JA et al，2000)。随后2001年苏明权谭庆荣等建立了一种能够特异性检测结核分枝杆菌和其他微生物的多重PCR方法(苏明权等，2000)。2005年王洪生李晓杰等利用特异性引物对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌菌悬液DNA进行多重PCR扩增，能特异性地区分这四种菌，但是其灵敏度不够(王洪生等，2005)。2007年孟祥红匡铁吉等利用多重PCR方法，设计三对特异性引物能检测出分枝杆菌，并能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，但是该方法不能区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(孟祥红，2007)。Gopinath等扩增hsp65、Rv3875、16S rRNA三个基因，可用于鉴别结核分枝杆菌以及禽分枝杆菌(Gopinath，2008)；Eduardo Eustáquio等扩增Rv2031c和IS6110两个基因，可用于鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Eduardo Eustáquio et al，2009)。但目前还没有报道可同时检测结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗4个菌种的多重PCR方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有结核病诊断技术检测速度慢、效率低、生物安全要求高等缺陷，提供一种简便、快速、灵敏度高、特异性好的病原快速诊断方法。本发明的第二个目的在于能够通过一次PCR同时完成对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非结核分支杆菌以及卡介苗的鉴别诊断试剂盒。

本发明以临床常见的4种分枝杆菌菌种(结核分枝杆菌，非结核分枝杆菌，牛分枝杆菌以及卡介苗)为研究对象，筛选出4个差异性基因序列16S rRNA、IS6110、Rv2652和Rv3873，并设计特异性引物，建立了一种多重PCR方法，通过在同一PCR扩增体系中同时鉴别检测四类细菌，用于结核杆菌的快速诊断和分型。实验室和临床样本验证实验证实，该方法可快速、准确地对结核分枝杆菌群成员进行检测与分型。

实现本发明的技术方案如下所述。

一种同时鉴别结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗的多重PCR试剂盒，它包含下列试剂组合物：

扩增16S rRNA基因片段的引物对：

引物1：5’ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3’，

引物2：5’CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3’；

(2)扩增IS6110基因片段的引物对：

引物3：5’CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3’，

引物4：5’TACTACGACCACATCAACCGGGAG3’；

(3)扩增Rv2652基因片段的引物对：

引物5：5’CGAGCACCAAAACGTCCCTC3’，

引物6：5’GACCCGAAACCCGGAAAGAG3’；

(4)扩增Rv3873基因片段的引物对：