[发明专利]GFP泄露试验方法

摘要

本发明公开了一种GFP泄露试验方法，属于毒理学检测技术领域。该方法采用转基因技术获得表达GFP(绿色荧光蛋白质)的动物细胞，然后制备细胞悬液和裂解液，分别与受试物孵育后检测GFP的荧光值，计算细胞GFP泄漏率和变性率。通过分析细胞GFP泄漏率和变性率与受试物MMAS值的关系，建立了一种通过GFP泄漏率和变性率判断受试物眼刺激性的替代试验方法。本发明所建立的检测方法成本低，操作简便快速、适用受试物谱广、预测准确性高、稳定性好，是一种有前途的眼刺激性替代试验方法。利用腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度、以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点。

主权项

一种GFP泄露试验方法，其特征在于，包括下列步骤：A.含有表达载体Pshuttle‑CMV‑GFP的腺病毒包装细胞的选择：293细胞培养于10％胎牛血清的RPMI1640培养基，SIRC细胞贴壁培养于10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为37℃，5％CO2；将含有Pshuttle‑CMV‑GFP目的基因的载体病毒转染293细胞中；B.腺病毒制备和滴度测定：取50ml 293细胞，70％铺满，常规细胞培养，使细胞数达到105/mL，用96孔酶标板铺板，每孔加入100μL细胞悬液，共铺10排；准备10个1.5mLEP管，每管加900μL的无血清RPMI 1640培养基，第一管加100μL病毒液，混匀；取100μL第一管的病毒液加入到第二管，按梯度稀释法稀释直到第九管；在上述96孔酶标板的每行加入一个稀释度的病毒液100μl，第10排加无血清的培养基作为阴性对照；37℃、CO2温箱孵化7‑10天，观察细胞出现CPE的情况；记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率：T＝101+d(S‑0.5)/mL；d＝Log 10稀释度；S＝各浓度中CPE细胞病变比率之和；根据KARBER公式计算出用于细胞感染的病毒滴度为107TCID50/mL；C.GFP阳性细胞悬液和细胞裂解液的制备：取80％汇合度的细胞，用已确定滴度的Pshuttle‑CMV‑GFP病毒液感染，24h后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率达到80％以上时，收集细胞，制备成5×105/mL细胞悬液；细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；D.受试物处理和荧光检测：将受试物用含1％牛血清白蛋白的0.1mol/L的PBS配成浓度为10％、1％和0.1％的溶液、悬液或悬浊液，向容积为500μL的EP管中加入200μL细胞悬液或细胞裂解液和200μL受试物；对照组以含1％牛血清白蛋白的0.1mol/L的PBS替代受试物以计算自溶发光值；每处理组重复样本数为3；在37℃摇床中孵育10min，加入细胞悬液的处理组以2000r/min离心10min，取上清液200μL加入96孔酶标板；加入细胞裂解液的处理组直接取200μL加入96孔酶标板，在酶标仪上以485nm和535nm测其发光度值；E.GFP漏出率、GFP变性率计算：GFP泄漏率＝[(受试物上清液发光度值‑对照上清液发光度值)/对照发光度值]×100％；GFP变性率＝[(对照裂解液发光度值‑受试物裂解液发光度值)/对照裂解液发光度值]×100％。