[发明专利]GFP泄露试验方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种毒理学检测方法，尤其是化妆品毒理学检测方法，属于毒理学检测技术领域。

背景技术

目前，活体兔眼刺激(Draize)试验广泛用于化妆品安全性评价，但因其评分系统存在主观性，同时由于大量使用试验动物，因对其造成损害而受到各动物保护组织的反对。在全球化动物保护运动的影响下，发达国家普遍开展了以替代、减少和优化为核心的“3R”运动。在化妆品安全性评价中，体外替代实验将逐步取代动物实验。因而，国内外科学家在发展科学可靠的眼刺激试验离体替代方法方面进行了大量探索，包括离体器官模型、绒毛膜尿囊膜试验和离体细胞试验等。在动物试验中，至少要对角膜、结膜及虹膜三种组织的病理反应进行观察并进行评分，单一的体外方法难以完全模拟所有组织的反应，目前尚没有任何一种方法有充分的试验依据证明能完全替代动物眼刺激性试验。目前研究较多的替代试验有鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、红细胞溶血试验、血红蛋白变性试验、MTT试验等。这些方法在操作简便性、适用的受试物谱、特异性和准确性等方面各有优缺点。

发明内容

为了克服现有试验方法的上述不足，本发明提供一种检测SIRC细胞(兔眼角膜细胞)中GFP(绿色荧光蛋白)泄露率的试验方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

GFP泄露试验方法，包括下列步骤：

A.含有表达载体Pshuttle-CMV-GFP的腺病毒包装细胞的选择：

293细胞培养于10％胎牛血清的RPMI1640培养基，SIRC细胞贴壁培养于10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为37℃，5％CO₂(一般2～3天传代一次)；将含有Pshuttle-CMV-GFP目的基因的载体病毒转染293细胞中；

B.腺病毒制备和滴度测定：

取50ml 293细胞，70％铺满，常规细胞培养，使细胞数达到10⁵/mL，用96孔酶标板铺板，每孔加入100μL细胞悬液，共铺10排；准备10个1.5mLEP管，每管加900μL的无血清RPMI 1640培养基，第一管加100μL病毒液，混匀；取100μL第一管的病毒液加入到第二管，按梯度稀释法稀释直到第九管；在上述96孔酶标板的每行加入一个稀释度的病毒液100μl，第10排加无血清的培养基作为阴性对照；37℃、CO₂温箱孵化7-10天，观察细胞出现CPE的情况；记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率(如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0)：

T＝10^1+d(S-0.5)/mL；

d＝Log 10^稀释度(如为10倍稀释度，d＝1)；

S＝各浓度中CPE细胞病变比率之和；

根据KARBER公式计算出用于细胞感染的病毒滴度为10⁷TCID₅₀/mL；

C.GFP阳性细胞悬液和细胞裂解液的制备：

取80％汇合度的细胞，用已确定滴度的Pshuttle-CMV-GFP病毒液感染，24h后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞GFP阳性率达到80％以上时，收集细胞，制备成5×10⁵/mL细胞悬液；细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；

D.受试物处理和荧光检测：

将受试物用含1％牛血清白蛋白的0.1mol/L的PBS配成浓度为10％、1％和0.1％的溶液、悬液或悬浊液，向容积为500μL的EP管中加入2001μL细胞悬液或细胞裂解液和200μL受试物；对照组以含1％牛血清白蛋白的0.1mol/L的PBS替代受试物以计算自溶发光值；每处理组重复样本数为3；在37℃摇床中孵育10min，加入细胞悬液的处理组以2000r/min离心10min，取上清液200μL加入96孔酶标板；加入细胞裂解液的处理组直接取200μL加入96孔酶标板，在酶标仪上以485nm和535nm测其发光度值；

E.GFP漏出率、GFP变性率计算：

GFP泄漏率＝[(受试物上清液发光度值-对照上清液发光度值)/对照发光度值]×100％；

GFP变性率＝[(对照裂解液发光度值-受试物裂解液发光度值)/对照裂解液发光度值]×100％。

本方法眼刺激性判定标准为：将GFP变性率或GFP泄漏率中任意一项大于等于25％的受试物判定为眼刺激阳性，将GFP变性率和GFP泄漏率同时小于25％的受试物判定为眼刺激阴性。