[发明专利]现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒

摘要

本发明公开一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒，是利用LAMP方法，针对灿烂弧菌设计了两对引物、具体的操作步骤及试剂盒，反应引物的DNA序列如下：VS-F3：5’-TGGTCCCCCCATATTCAGAC；VS-B3：5’-AAGTACCCCGAGGAAGAGAA；VS-FIP：5’-GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC；VS-BIP：5’-GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC。不需要昂贵的仪器设备和很长的检测时间，即使在病原极少的情况下也能够检测出来，具有操作简便、成本低廉、检测准确等优点，可以做到实时监控，及时发现疫情，减少疫病的发病趋势，早期预防病原蔓延，避免给养殖户带来更大的损失。

主权项

一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a.分别取海参样品0.08～0.12克，置于多个不同编号的样品采集管中，将样品磨碎至浆状；b.分别蘸取不同编号样品采集管中的浆状海参样品，再置入对应编号且内装膜片的采样管中并将膜片润湿；c.分别吸取无水乙醇2～3滴，滴于不同编号的采样管内及内装有膜片的阳性对照管和内装有膜片的阴性对照管中，搅动各管内膜片30秒；d.将c步骤所得膜片分别转移到对应编号且内装高纯水的膜片漂洗管内，将膜片漂洗管震荡3～4分钟；e.将漂洗管内的膜片分别转移到相应编号且内装有TE缓冲液的核酸变性管内，95℃保温4分钟，然后再迅速置于冷水或室温条件下2分钟；f.再将上述核酸变性管内的膜片转移到相应编号的扩增检测管内，将扩增检测管置于61～63℃保温60分钟；85～90℃条件下保温5分钟，然后迅速将扩增检测管上下反复甩动1分钟；所述扩增检测管内装有扩增反应液，扩增反应液组成成分如下：反应引物VS‑F3和VS‑B3各0.2μmol/L，VS‑FIP和VS‑BIP各1.6μmol/L，pH8.8的TrisHCl 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO46mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，Triton X‑1000.1％，Betaine1.6mol/L，dNTP 1.6mmol/L，8U Bst DNA聚合酶；所述扩增检测管盖内由石蜡和聚乙二醇的混合物将0.1μl核酸染料固定在管盖的上方；编号为阳性对照管的扩增检测管内的扩增反应液中还含有海参腐皮综合症致病病原的核酸DNA质粒标准液10‑4个拷贝；所述反应引物的DNA序列如下：VS‑F3：5’‑TGGTCCCCCCATATTCAGAC；VS‑B3：5’‑AAGTACCCCGAGGAAGAGAAVS‑FIP：5’‑GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC；VS‑BIP：5’‑GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC；g.用力向下甩动扩增检测管，目测、对比扩增检测管底部反应液颜色。